世界的な疾病診断のためのレーザーダイオードを搭載したレインボーポータブルサイトフォンに向けて

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8671 (2022) この記事を引用

1908 アクセス

2 引用

16 オルトメトリック

メトリクスの詳細

In vivo では、Cytophone は、前例のない 1,000 倍の感度向上により、血流中の循環疾患マーカーを直接光音響検出することで、がん、感染症、心血管障害の早期診断が可能であることを実証しました。それにもかかわらず、より高い特異性と移植性を備えた Cytophone が緊急に必要とされています。ここでは、小型マルチスペクトルレーザーダイオードアレイ、時間カラーコーディング、高速時間分解信号処理を統合した新しい Cytophone プラットフォームを紹介します。 2 色 (808 nm/915 nm) レーザーダイオードを使用して、血液バックグラウンドとアーチファクトに対するマラリア感染赤血球内の白と赤の血栓、黒色腫細胞、ヘモゾインのスペクトル識別を実証しました。 Plasmodium yoelii マウスモデルおよび培養ヒト熱帯熱マラリア原虫からのデータは、共焦点光熱顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて in vitro で検証されました。これらの技術により、侵入後 4 時間以内に感染細胞が検出されたため、ヘモゾインはマラリア進行の初期段階におけるスペクトル選択マーカーとして有望です。黒色腫、菌血症、鎌状貧血、血栓症、脳卒中、および異常なヘモグロビン形態の診断を目的とした従来のレーザーを使用したサイトフォンの以前の応用結果と合わせて、この現在の発見は、マルチスペクトルレーザーを備えたポータブルレインボーサイトフォンの開発の可能性を示唆しています。これらおよび他の病気を識別するためのダイオード。

先進的なレーザーを使用した病気の診断は大幅な進歩を遂げています1。さまざまなレーザー法の中でも、光音響 (PA) 技術は、感度、非侵襲性、および最大 3 ～ 5 cm2、3、4 の生体組織への深さの侵入において利点を示しています。いくつかの PA イメージングデバイスは、クローン病の状態の評価 5、乳がんの診断 6,7、頸静脈の血液酸素化のモニタリング 8 など、ヒトの in vivo で有望な臨床結果を実証しています。これらおよび他の多くの病状の診断は、多くの場合、患者の血液検査から始まります。しかし、既存の血液検査では、採取される血液量が少ないため（通常、静脈サンプルの場合は 5 ～ 10 mL、毛細血管サンプルの場合は数 μL）感度が制限され、最大 103 ～ 104 個の異常細胞が見逃されるため、早期診断を行うことができません。または全血液量中のバイオマーカー（成人で約 5 L）9. この欠落した細胞の大部分は、循環腫瘍細胞 (CTC)、細菌、血栓によってそれぞれ形成される転移、敗血症、脳卒中など、治療が困難すぎる疾患の進行を引き起こす可能性があります9,10。特に、多様な CTC アッセイの開発には多大な努力が払われているにもかかわらず、感度が低くデータに一貫性がないため、臨床使用はまだ推奨されておらず、その結果、特に疾患の早期診断においては診断価値が不明確です 10,11。さらに、ほとんどの既存の PA 技術、特に PA イメージングは、皮下血管内に存在する場合でも、典型的な速度 5 ～ 10 cm/s で高速で移動する循環疾患バイオマーカーを検出できず、その有用性はさらに制限されています 10。

これらの制限は、蛍光、光熱（PT）、ラマン、特に PA 検出法とそれらの組み合わせによる in vivo フローサイトメトリーの原理を使用して、in vivo でより大きな血液量を評価することで解決できます 11、12、13。これらの方法の中で、in vivo PA フローサイトメトリー (PAFC) は、血流中の細菌 (黄色ブドウ球菌や大腸菌など)、血栓、鎌状赤血球、エキソソーム、さまざまな形態のヘモグロビン (Hb) の直接検出に臨床的関連性があることが実証されています。）（例、オキシ-、デオキシ-、メタ-Hb）、ナノ粒子（NP）、および固有（例：メラニン、Hb、Hz [ヘモゾイン]、シトクロム、カロテノイド）または人工（例、金 NP）PA を使用した CTC造影剤9、12、14、15、16、17、18、19、20。臨床試験では、PAFC は in vivo で黒色腫患者の CTC、血栓、および CTC 血栓塞栓を検出する既存の診断方法と比較して、前例のない約 1,000 倍の感度向上をもたらしました 21。また、我々は、in vivo PAFC が、動物モデルにおいて 0.0000001% レベルの寄生虫血症で循環マウスのマラリア感染細胞を検出できる可能性があることを実証しました 14,15。

それにもかかわらず、資源に制約のある国での PAFC の使用は、一般的に使用される固体パルスレーザー (フラッシュランプ、ダイオード励起、Q スイッチ、ファイバーなど) の技術的な複雑さ、大型、高コストによって制限されています。に基づく）1、12。これらの制限により、特に NP、Hb、Hz のスペクトルフィンガープリントとも呼ばれる、異なる吸収スペクトルを持つバイオマーカーのスペクトル同定に役立つ、異なる波長のレーザーのアレイを使用することが非常に困難になります 22,23,24 、25、26、27、28、29、30、31、32、33。具体的には、PA 分光法におけるスペクトル調整可能なレーザーダイオードの先駆的な最初の応用 34 の後、PA イメージングにレーザーダイオードを使用する試みがいくつか行われました 35,36。しかし、レーザーダイオードのパルスエネルギーは低すぎて (数マイクロジュール [μJ] のレベル)、十分な感度を提供できませんでした。また、パルス持続時間は、PA 信号の高効率生成のための音響閉じ込めに適合するように、小さなターゲットを横切る音響伝播時間と比較して比較的長かった (90 ～ 120 ns)。最近、0.1 × 5 mm2 から 40 × 50 mm2 のエミッタアレイサイズを使用し、パルス幅 15 ～ 30 ns、パルスエネルギー 0.1 ～ 2 mJ の、より強力なレーザーダイオードの開発において大きな進歩が見られました37。ただし、PAFC でのこれらのレーザーの使用についてはほとんど進歩がありません。ここで説明する研究の目標は、小型レーザーダイオードアレイと時間スペクトル光変調、時間分解能を統合する革新的な PAFC ベースのレインボー (つまり、マルチカラー) Cytophone プラットフォームを使用して、この研究分野のギャップを埋めることです。各高速移動細胞またはバイオマーカーからの時間色分けされた PA 信号の検出と高速信号処理。従来のレーザー源と比較して、新しいレーザーダイオードの利点には、サイズが小さいこと、マイクロ光学系を備えたコンパクトなエミッターアレイの使用、低コスト、高繰り返し率、必要なレーザーエネルギー、および適切なパルス持続時間が含まれます。

レーザーダイオードを備えた当社のレインボーサイトフォンのユニークな性能を説明するために、当社の新しいプラットフォームが、白色および赤色の血餅、模倣黒色腫細胞、およびマラリア感染者のヘルツを含む複数の循環物体の固有のスペクトルを識別する能力を備えていることを実証します。血液バックグラウンドおよびその他のアーチファクトの中の赤血球 (RBC)。固体レーザーを用いたこれまでのマラリア関連研究 14,15 に基づいて、我々は現在、PAFC の特異性の向上を可能にする新しい有望な光源としてレーザーダイオードの可能性を探求しています。この研究では、低いパルスエネルギー、高い放射発散（特にレーザーダイオードアレイの場合）、異なる波長のレーザーダイオードパルスによって高速移動する感染した単一細胞で生成される多色PAシグナルの高速検出とフィルタリングなどの課題を克服する必要がありました。。私たちは特にマラリアに新しいプラットフォームを集中させました。マラリアは依然として最も重大な感染症の一つであり、世界人口のほぼ半数が危険にさらされており、2020 年だけで 2 億 4,100 万人の臨床症例と 62 万 7,000 人の死亡者をもたらしました22。死亡の96%以上はアフリカで発生しており、ほぼすべてが熱帯熱マラリア原虫によるものですが、世界中で少なくとも他の4種がヒトへの感染の原因となっています。マラリアは、赤血球における寄生虫の侵入と増殖に続いて鉄が豊富な Hz が生成されるため、PAFC の潜在的に理想的な使用例を表します。これは、黒色腫 CTC で検出されるものと類似した PA コントラストを利用することで検出できます。メラニンとHzの間の光学的および幾何学的特性14。マラリア診断のゴールドスタンダードは、種の識別と寄生虫の定量を可能にする血液サンプルの光学顕微鏡検査でしたが、流行地域では新しい定性的迅速診断検査（RDT）がすぐに顕微鏡検査を追い越しました23、24、25、26、27、28、29。、30、31、32、33。残念ながら、どちらのポイントオブケア診断も感度が限られており、検出限界は 50 ～ 200 個のマラリア感染赤血球 (iRBC)/μL で、実行には少なくとも 20 ～ 30 分かかり、RDT は標的抗原の欠失によってますます妨げられています。従来のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、特に RNA ベースの方法は感度が 1 寄生虫/μL 以上まで改善されていますが、時間、機械、消耗品の需要、さらには時間、機械、消耗品の需要により、ポイントオブケア環境での有用性は限られています。微量の汚染物質が誤診につながる可能性があるため、間違いが発生しやすくなります23。

世界保健機関 (WHO) は、2030 年までに世界中でマラリア関連死亡を少なくとも 90% 削減することを目指しています22。しかし現在、市販されているマラリア検査には妥当なコストがあり、無症状の個人を特定するのに十分な感度を備えた検査はありません。マラリア撲滅における重大な障害となっている。私たちの研究は、必要とされる携帯型、非侵襲性 (針なし)、ラベルフリー (造影剤不使用)、安全 (皮膚損傷、痛み、血液汚染の心配がない) の装置を開発することで、WHO の要請に応えることができます。今回我々は、小型で費用対効果の高いレーザーダイオードを備えた新しいレインボー（多色）Cytophoneプラットフォームを使用して、インビトロおよびインビボでのマウスモデルにおけるプラスモディウム感染赤血球の迅速（数秒）検出とリアルタイム同定を行うことを報告する。人間への翻訳の可能性が高い。

新しいレインボー Cytophone プラットフォーム (図 1a) の際立った特徴は、異なる波長のレーザーパルスを生成するマルチスペクトルレーザーダイオードアレイの使用と、時間色コーディングのための時間遅延 (図 1b) です。このプラットフォームを検証するために、808 nm と 915 nm の 2 つの波長でナノ秒 (15 ～ 25 ns)、高パルス繰り返しレート (1 ～ 3 kHz) のレーザーダイオードパルスを適用しました。無傷の皮膚を通して血管に経皮レーザー照射を行うと、正常赤血球 (nRBC) の Hb や、近赤外線では nRBC の Hb よりも iRBC の方が局所吸収が高い Hz などの光を吸収する PA 造影剤の温度が上昇します。（NIR）領域（図1c）。加熱されたゾーンの急速な熱膨張により、PA信号と呼ばれる熱音響波が発生し、小型（直径数mm）の超音波（US）トランスデューサで検出されます（図1a）。

In vivo Rainbow Cytophone 診断プラットフォーム。 (a) 2 色の Cytophone の原理。挿入図は、iRBC 構造の概略図 (上、左) と、Hz ピークを持つ実際の iRBC の光熱 (PT) 画像 (下、右) を示しています。 (Adobe Fireworks CS5、www.adobe.com) (b)。同期された（例：色素沈着した皮膚からの）偽信号と非同期の偽信号のバックグラウンドでの iRBC のスペクトル識別（中央）のための、λ1 と λ2 の異なる波長を持つ 2 つの高繰り返し率レーザーパルスの時間カラーコーディング（上）底）。 (c) メラニン、nRBC、Hz、インドシアニングリーン (ICG)、および磁気ビーズの吸収スペクトル 14、15、16、17、18、19、20、21。 (d) 多くの nRBC および循環血栓 (CBC) によって生成された血液バックグラウンドに対する陽性および陰性 PA コントラストを伴う PA トレース。

検出ボリューム内のnRBC内のHbからのPAシグナルは、トレースベースラインを作成します（図1d）。 nRBC の Hb バックグラウンドを超える高い Hz 関連の局所光吸収を持つ iRBC が検出 (つまり、照射) ボリュームを通過すると、対応する吸収が増加し、血液バックグラウンドを超える鋭い正の一時的な PA ピークが生成されます。比較のために、白と赤の循環血栓 (CBC) は陰性と陽性の PA ピークを生成します (図 1d)。

iRBC の Hz と nRBC の Hb の吸収スペクトルの独特の特徴、特に 770 ～ 930 nm のスペクトル窓における吸収の違いに基づいて、2 つのレーザーで iRBC をスペクトル的に識別する Cytophone の能力を実証するために 2 カラーモードを選択しました。 808 nm および 915 nm のパルスと、時間カラーコーディング用の短い電子時間遅延 τE (10 μs) を使用します (図 1b、上)。繰り返し率3 kHzのこれらのパルスは、同じ高速移動する個々の細胞と相互作用し、検出ボリュームを通過するときに同じ細胞から時間色分けされたPA信号を生成します（図1a）。具体的には、iRBC は 915 nm よりも 808 nm で高い振幅の PA 信号を生成します (図 1b、中央)。一方、nRBC は赤色 CBC と同様に、808 nm よりも 915 nm で高い振幅の PA 信号を生成します (図 1b、下、右）。時間カラーレーザーパルスコーディングと時間分解PA信号検出を組み合わせることで、トランスデューサに到達する血管内のiRBCからの同期した真のPA信号のペアを、十分に分解された音響時間で識別することも可能になります（図1a）。色素沈着した皮膚層からのペアの同期したバックグラウンド信号（図1b、下、左）およびレーザーパルスと非同期の異なる偽信号（図1b、下、中央）と比較した遅延τA（≧0.2μs）原因（振動、環境音響、電磁干渉など）。

Cytophoneでは、マイクロレンズアレイを使用したいわゆるファストアクシスコリメーション（FAC）システム（図2a、b）の後、2つのレーザーダイオードからのビームがダイクロイックミラー（図2a）で同軸方向に混合されます。。集束光学系は球面レンズと円筒レンズで構成され、幅約 80 µm、長さ 1 mm の線状ビームを形成します。 2 つのコンパクトなエミッターアレイ (図 2b) は、110 ～ 130 μJ のエネルギーを持つ 2 つの波長パルス (図 2c) を提供します。生体組織内での光散乱によりレーザービームがぼやけ、光学解像度が大幅に低下します（図1a）。より高い空間分解能を提供するために、横方向分解能 65 ± 9 µm の集束円筒 US トランスデューサーを使用した音響分解能 Cytophone の回路図を適用しました。円筒形のトランスデューサー構成により、nRBC からの検出量、つまり血液バックグラウンドを最小限に抑えることができ、それによって iRBC からの信号対雑音比 (SNR) を最大化しながら、血管断面全体のすべての iRBC を同時に評価できます。典型的なバイポーラ波形 (図 1b、中央) で PA 信号を収集するために、プラットフォームにはアナログ - デジタルコンバーターボードが装備されました。 PA 信号波形は、SNR を高めるために 4 ～ 16 回平均化され、従来のフローサイトメトリーと同様にトレースに変換されました 12 (図 1d)。その結果、Cytophoneは、血液バックグラウンドに対して正および負のコントラストを持つトレースピークを生成します（図1d）。次に、カスタマイズされた MATLAB ベースのソフトウェアを使用して、確立されたバックグラウンドレベルを超える各ピークの特性 (振幅や幅など) を分析しました。

2 つのレーザーダイオードを備えた生体内 2 色 Cytophone セットアップ。 (a) 光学方式。 (Adobe Fireworks CS5、www.adobe.com) (b) 2 つの波長を備えた 2 つのレーザーダイオードモジュールの写真。 (c) 中心波長 808 および 915 nm のレーザーダイオード発光のスペクトル。 (d) 532 nm (上) および 820 nm (下) でのマウス耳断片の PA 顕微鏡画像。 FAC = 速軸コリメーションシステム。 ADC = アナログデジタルコンバータ。

高度なレーザーダイオードを備えた音響分解能 Cytophone プラットフォームが診断価値と高いスペクトル特異性の両方を提供できるかどうかを調査するために、波長 532、671、820、1,064 の固体レーザーを使用する従来の PAFC と生体内および生体外でのパフォーマンスを比較しました。んー。そのために、当社の先進的な血管ファントム 38,39 と、黒色腫 CTC を模倣した磁気ビーズを含む疾患関連 PAFC 造影剤 38 を使用しました。薬剤をマウスの体内に静脈内または腹膜に送達し、続いて直径40〜60μmの耳血管内でPAを検出しました（図2d）。 820 nm での血管の PA コントラストは 532 nm よりも低く (約 20 倍)、これは Hb の吸収スペクトルと相関しています (図 1c)。 iRBC の Hz 吸収はほんのわずかしか減少しないため、このスペクトルシグネチャーは血液バックグラウンドを上回る iRBC の PA コントラストを増加させます。

2 つの波長のレーザーダイオードを備えた 2 色の Cytophone は、最初に、よく制御可能な流れ条件下で高速移動する血球、CTC、および血餅ファントムを備えた動的血管ファントムを使用した動的条件下での従来の PAFC 造影剤のスペクトル同定を通じて in vitro で検証されました 38。、39。このファントムは、医学的に適切な散乱吸収特性を持つ生体組織をモデル化した TiO2 ナノ粒子を含むポリ塩化ビニルプラスチゾル、色素沈着した皮膚を模倣したメラニン表層、血管を模倣した異なる直径と深さのプラスチックチューブ、細胞ファントムと細胞を移動させるポンプで構成されていました。実際の細胞の速度は 0.5 ～ 5 cm/s です。偽の信号を生成する可能性のある流動細胞およびアーティファクトを模倣するために、(1) 黒色腫細胞の吸収と同様に、NIR 範囲で吸収を持つ 8 μm 磁気ビーズをテストしました (図 1c)。 (2) ヒト血液中の赤血球凝集体は赤色 CBC を模倣します。 3) 白色 CBC ファントムとしての 100 µm の光学的に透明なシリカビーズ。 (4) インドシアニングリーン (ICG) 色素は、赤い CBC ファントムとして ICG 凝集体によるバルク吸収バックグラウンドを提供します。 (5) 市販の Hz。

私たちの最初の研究では、2色のCytophoneの性能を推定するために、808 nm付近の最大波長で十分に特徴付けられた吸収スペクトルを持つICG色素を使用しました（図1c）。従来の明視野顕微鏡を使用して、比較的均一な溶液中に小さなICG凝集体が存在することを確認しました（図3a、右）。 ICG 吸収バックグラウンド溶液を超える ICG 凝集体のより高い局所吸収により、直径 1 mm の血管ファントム内で 1 cm/s の速度の流れでベースラインを超える鋭い正の PA ピークが生成されました (図 3a、左)。。 915 nm (使用した 2 番目の色) での ICG の光吸収は 808 nm よりも約 9 倍低いため、これらのピークは 808 nm で優先的に現れます (図 1c)。

動的血管ファントムを使用した、in vitro での正および負のコントラストによる従来の PA ターゲットのスペクトル同定による 2 色 (808 nm/915 nm) サイトフォンの性能の検証。 (a) 比較的均一な ICG 溶液中の稀なインドシアニングリーン (ICG) 凝集体からのポジティブコントラストピークを伴う PA トレース (左) と ICG 凝集体の明視野画像 (右)。 (b) 「1 色」アーチファクトを伴う血液中の RBC 凝集体からの 2 色の PA トレース (左) と RBC 凝集体の明視野画像 (右)。 (c) 白色循環血餅 (CBC) ファントムとしてのシリカビーズからのネガティブコントラスト PA ピーク (左) および単一ビーズの明視野画像 (右)。（ d ）血液中の赤白 CBC からの正および負のコントラスト PA ピーク（左）および血液中の混合赤白 CBC の明視野画像（右）。 (e) 多くの 8 μm 磁気ビーズの背景にある 23 μm 磁気ビーズからの 2 色のポジティブコントラスト PA シグナル。 (f) 合成 ~ 200 μm Hz の 2 色のポジティブ PA ピーク。

次に、血液中の赤血球凝集体（図 3b、右）から 2 色の PA ピーク（図 3b、左）を取得しました。 808 nm および 915 nm での PA ピーク振幅は、RBC 吸収スペクトルと一致しています (図 1c)。また、追加された ICG 凝集体に関連する 808 nm の単一ピークも観察されました。これらのデータは、2 色の Cytophone が、特定の指紋に基づいて他のアーティファクトの存在下で選択されたターゲット (つまり、赤い CBC) を識別できる可能性があることを示唆しています。

2色Cytophoneの性能をさらに評価するために、nRBC関連のバックグラウンドよりも低い吸光度により負のコントラストピークを提供する白色CBCを識別する能力を推定しました（図1d）。直径100μmのシリカビーズ（図3c、右）30mgをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1.5mLに加えて懸濁液を作成し、微粒子の沈降と凝集を防ぐために懸濁液を15分ごとに振盪しました。次に、血液バックグラウンドをモデル化するために ICG ソリューションを追加しました。個々の透明なシリカビーズがレーザービーム領域を通過するとき、検出ボリューム内の吸光度の突然の低下に関連する、2色（808 nm / 915 nm）の狭い負コントラストのPAピークが観察されました（図3c、左）。ヒト血液中の赤と白の混合 CBC (図 3d、右) は、915 nm で正および負のコントラスト PA ピークを生成しました (図 3d、左)。過去に、我々はナノ秒固体レーザーを利用して、同様の CBC パラメーターを使用して同等の負の PA コントラスト 16,46 を取得しました。これらの結果の類似性は、同じ用途において固体レーザーをレーザーダイオードに置き換える可能性を示しています。

次に、多くの 8 µm 磁気ビーズ (3,960 µL の PBS に 40 µL の 1% ビーズ) のバックグラウンドで比較的まれな 23 µm 磁気ビーズを使用し、それぞれ CTC ファントムと nRBC ファントムの代用として機能しました38。小さなビーズでモデル化された「血液バックグラウンド」の上に、個々の比較的大きな磁性ビーズから多くの2色（808 nm / 915 nm）の一時的な狭い陽性ピークが観察されました（図3e）。 PA ピーク振幅 (赤、808 nm、青、915 nm) は、磁性微粒子の吸収スペクトルと一致します (図 1c)。これらのデータは、同様の条件下で 1,064 nm レーザーを使用して以前に測定された 5 ～ 12 の範囲の SNR で非常に類似しています 38。繰り返しになりますが、この同等の感度は、同様の用途でレーザーダイオードを使用できる可能性を示しています。

最後に、マラリア関連 Hz を検出するレーザーダイオードの可能性を検証するために、光吸収スペクトルと形態 (サイズと形状) (図 S1) が天然の Hz と類似している市販の Hz の in vitro 検出を試みました 30,31。 32、33。私たちの結果は、Cytophoneが915 nmよりも808 nmのPA信号振幅でよりよくHzを検出できることを示しており（図3f）、これはHzの吸収スペクトル（図1c）と相関しています。

結論として、in vitro 流動条件を使用して、レーザーダイオードを備えた Cytophone プラットフォームが複数のターゲット (ICG 凝集体、磁気ビーズ、白色および赤色 CBC、Hz など) を検出および識別できる可能性があることを実証します。

PA技術として十分に確立されている造影剤を用いたin vitroでの包括的な検証の後、対照マウスと感染マウスの耳微小血管からのPA信号をモニタリングすることにより、in vivoでのCytophoneの性能をテストしました（図2d）。 5 匹の健康なマウスの最初のコホートから収集されたデータを使用して、パラメータをさらに最適化しました。 PA プローブは、光学集束チップと US 集束トランスデューサーで構成され、選択された静脈の上の耳の皮膚に配置され、標準的な US ジェルが音響結合を提供しました。検査対象の静脈上のトランスデューサー焦点ボリュームのナビゲーションは、PA プローブがさまざまな方向に走査される際の PA 信号の光学イメージングとモニタリングによって正確に制御されました（図 S2）。選択された静脈からの PA 信号振幅は、皮膚からのバックグラウンド信号よりも 1.65 ± 0.32 (SD) 倍高かった。典型的な幅0.06〜0.1μsのPA信号（図4a）は、典型的な深さ200〜250μmの血管から、顕著な音響時間遅延（0.15〜0.3μs）を伴ってトランスデューサに到達しました。これにより、循環物体のみからの信号の時間分解 PA 検出により、サイトフォンの感度に対する皮膚からの PA バックグラウンド信号の影響を簡単に排除することができました。その結果、対照マウスでは、2つの波長で確立された血液バックグラウンドを超える一時的な陽性PAシグナルは観察されませんでした（図4b）。血液バックグラウンド (ベースライン) の低振幅変動 (通常 3% ～ 5%) は、レーザーエネルギーの変動、電気的および音響的ノイズ、振動、生理学的運動、および検出ボリューム内の nRBC 数のわずかな変動に依存します。。 nRBC の数は、小さな血管 (10 ～ 15 μm) ではより深くなります。

対照マウスおよび P. yoelii GFP+ 原虫によるマラリア感染マウスにおける 2 色 (808 nm / 915 nm) PA トレースの in vivo モニタリング。 (a) 皮膚と比較した、耳血管からの対照マウスにおける PA 信号波形の時間分解検出。 (b) 健康な (対照) マウスからの in vivo PA 追跡。 (c) RBC 凝集体を含む非感染マウスからの in vivo PA トレース。感染後 13 (d)、16 (e)、および 21 (f) 日目の感染マウスからの in vivo PA トレース。（g）PAFC（下のトレース）と蛍光フローサイトメトリー（FFC）モジュール（上のトレース）を統合したPAFFCプラットフォームを使用して同じ感染マウスをテストすることによる、レーザーダイオードベースのCytophoneデータの生体内検証。 (h) PA 速度 (1 分あたりの PA シグナル数) の感染後の時間に対する生体内依存性。

次に、RBC 凝集体 (つまり、赤色 Hb に富む CBC) を in vivo で検出する Cytophone の能力をテストしました。十分に確立された手順 12、21、46 と低温を使用して、高速光学イメージング 46 で識別された RBC 凝集体を作成しました。検出（照射）ボリューム内を移動する凝集体は、2色のチャネルで同時に一時的な陽性PAピークを作成しました（図4c）。同じレーザーエネルギーでの振幅は、血液吸収スペクトルと一致して、808 nm よりも 915 nm の方がわずかに高かった（15 ～ 20%）（図 1c）。

次に、GFP を発現する P. yoelii をマウスに腹腔内注射しました 14。寄生虫血症は、約 1 か月間にわたって毎日 PA 信号の振幅と速度 (時間単位あたりの PA 信号の数) をモニタリングすることによって評価されました (図 4d–f の選択された例を参照)。レーザーダイオードで得られたデータを検証するために、波長 671 nm のパルス固体レーザーを使用して PA シグナルを生成する、より確立された PAFC と蛍光フローサイトメトリー (FFC) の統合システム (PAFFC と呼ばれます)14 で同じマウスをテストしました。また、GFP を発現する寄生虫の発光を励起するための 488 nm の連続波 (CW) レーザーも使用します。マルチモーダルPAFFC容量により、それぞれiRBC内にGFPとHzの両方を含む寄生虫からのFL信号とPA信号の時間的一致を通じてiRBCを識別することができました（図4g）。ＰＡピークのみの存在（すなわち、ＦＬ関連ピークではない）は、Ｈｚが血漿中に単独で存在するか、またはＷＢＣ（例えば、好中球）中にＨｚが取り込まれていることを示した１４、２６。

一般に、PAFFC は、同じ感染マウスにおける iRBC の存在を示す Cytophone データを確認しました。感染マウスの PA シグナルを 1 か月間モニタリングすると、マラリア進行中の次の傾向が明らかになりました。(1) 最初の 15 日間 (13 日目に開始) から 16 日間、シグナル速度が徐々に増加しました。 2) 15 ～ 17 日で最大値に達します。 (3) 最終的には減少して 28 ～ 30 日までに完全に消失します (図 4h)。これは以前の研究と一致しています 14,15。このパターンはよく説明されており、マウスモデルにおける免疫媒介クリアランスに関連しています14。レーザーダイオードで得られたデータは固体レーザーで得られたデータと一致しています 14,18 が、血管の位置、流量、免疫反応に応じて若干異なる特徴がいくつかあります。

尾静脈に注入された人工 Hz、磁性 NP、および B16F10 黒色腫細胞の in vivo PA モニタリングにより、磁性 NP および黒色腫細胞 (図 S3) が比較的迅速に (20 分から数時間) 除去されることが明らかになりました。これは、我々の結果と一致しています。前回の結果9、12。血管に沿った PA プローブのスキャン中に、ランダムな空間分布を持つ定常 PA 信号が観察されました。これらの信号は振幅が比較的安定しており、高速で移動する iRBC によって生成される鋭い (つまり、持続時間が短い) 一時的な PA ピークとよく区別できました。この所見は、隔離された（すなわち、血管壁に付着した）iRBCが存在する可能性を示唆している。注目すべきことに、内皮血管および他の組織への iRBC の隔離は、マラリアにおけるよく知られた現象です 23,25。

次に、流れる血液サンプルを含む動的血管ファントムを使用して、同じサイトフォン/レーザーダイオードとPAFFC/固体レーザープラットフォームを使用して、プラスモジウム感染マウスからの生体外サンプルを分析しました38,39。 2色サイトフォン（図5a）またはマルチモーダルPAFFC（図5c）のいずれでも、対照血液サンプル（すなわち、非感染マウス）の血液サンプルでは、確立されたノイズレベルを超える信号は観察されませんでした。対照的に、GFP 発現 P. yoelii を含む iRBC からの Hz 関連 PA シグナルと GFP 関連 FL シグナルは、対の in vivo データで見られたのと同じ感染段階で同様の割合で観察されました。具体的には、2色のPAピークの時間的一致（図5b）はHzの吸収スペクトル（図1c）と相関しており、PA信号のHz関連の起源を明確に示しています。さらに、HzがGFPを発現するP. yoelii-iRBC内に位置するはずであることを考慮すると、PA信号とFL信号の時間的一致（図5d）はこの結論を裏付けます。識別に十分な Hz 関連 PA 信号振幅は、バックグラウンドノイズを超えてレーザーダイオードによって誘導され (図 5b)、固体レーザーによって誘導されたものと同等でした (図 5d)。これは、Plasmodium-iRBC を検出する Cytophone の能力を検証します。さらに、PA チャネルの SNR は通常 FL チャネルよりも高く、FFC モジュールと比較して診断プラットフォームとして Cytophone が有利であることを示しています。さらに、FFC では in vivo での iRBC の標識が必要ですが、これは簡単ではなく、ほとんどの FL 標識は人間にとって有毒です。

血管ファントムを使用した in vivo Cytotophone データの Ex vivo 検証。 808 nm および 915 nm の 2 つのレーザーダイオードを備えた Cytophone を使用した、感染後 13 日目の (a) コントロール (非感染マウス) および (b) GFP + P. yoelii 感染マウスの血液からの 2 色の PA トレース。（ c ）PAおよび蛍光（FL）信号の生成のために671 nmのパルスレーザーと488 nmの連続波レーザーを備えたPAFFCプラットフォーム（PAFCおよびFFCモジュールを統合）を使用した、対照血液からの蛍光およびPAトレース。（ d ）PAFFCプラットフォームを使用した、13日目のGFP + P. yoelii感染マウス血液からのex vivo蛍光およびPAトレース。 2 色の PA トレースは、(e) 対照ヒト血液および (f) インビトロ培養からの熱帯熱マラリア原虫-iRBC から 671 nm および 820 nm のレーザーを使用して 2 色の Cytophone プラットフォームで得られました。 (g) トレースの断片。同じ iRBC からの異なる波長での PA ピークの時間的一致を示します。

PA データを検証するために、我々は共焦点光熱顕微鏡 (PTM) 40,41,42,43,44,45 も適用しました。この技術は、PA 技術と非常によく似た物理原理 (つまり、吸収された光エネルギーの変換) を備えた当社が開発した技術です。熱に変換されますが、in vitro イメージング解像度は向上しています40、41、45。 Cytophone は加熱ゾーンの熱膨張により PA 波を検出しますが、PTM では、温度に敏感な屈折率の変化によるプローブビームの焦点ぼけを通じて熱効果が検出されます 40、41、42、43、44、45。他の光学技術と比較した in vitro PTM の利点は、感度と空間分解能が向上していることであり 41、PTM ベースの視覚化単独または細胞内でシングル Hz ナノ結晶を識別する Cytophone の機能を検証できるようになります。前述したように、自然な Hz30、31、32、33 に似た特性を持つ市販の Hz を使用しました。 TEM、STEM、および EDS 機器（図 6a-c、補足図 1Sa-d）は、初期核形成プロセス中に最小サイズ 60 の非理想的な立方体球状ナノ結晶として開始され、Hz のサイズと形状の高い不均一性を実証しました。最大長は 80 nm で、サイズ比 (長辺と短辺) が 2:1、ほとんどの場合は 3:1 の細長い構造に変化し、最大長は 1 mm になります。成長中に、単一のナノ結晶が個々のナノ結晶の鎖 (「線状クラスター」) を形成することがあります。高濃度では、Hz は頻繁に凝集し、平均 Hz クラスターサイズは 250 ～ 500 nm で、中央値は 320 nm です。 TEM や STEM とは異なり、PTM は通常、高度に特殊で時間のかかる準備を必要としません (わずか数分)。 40×対物レンズを使用した場合、HzのPTM画像は同様の結果を示し、中央値330 nmの周りで非常に対称的なサイズ分布（図6i）を伴う不均一性（図6e〜g）を含みました。 Hz クラスターの超音波崩壊後、100 倍の対物レンズを備えた PTM は、220 nm レベルの回折限界分解能で個々の Hz ナノ結晶を区別することができました（図 6f）。これらのナノ結晶は、黒色腫細胞のメラニンナノ粒子と同等以上の振幅を有する十分に検出可能なPAシグナル（例えば、図3fおよびS3a）を提供しました（図S3b、c）。黒色腫の研究に PA および PT 技術を使用することは十分に確立されているため 21、これらの技術は、従来のレーザー光源を置き換えることができるレーザーダイオードを使用してマラリア検出に簡単に採用できます。

Cytophone および PTM システムのキャリブレーションに使用されるヘモゾイン (Hz) 単独の特性評価。 (a) Hz クラスターの STEM 画像。単一 (b) およびクラスター化 (c) Hz の TEM 画像。 (d) 合成 Hz の吸収スペクトル。 Hz のスペクトル吸光度と、比較のための直径 5.5 μm の磁性微粒子。超音波処理（24 kHz、5 分）後の低協奏（5 μg/mL）での小さな個別 Hz および高協奏でのクラスター化 Hz の透過/明視野（e）および（g）および光熱（f）および（h）画像(25μg/mL)。 (i) 光熱顕微鏡 (PTM) で得られた Hz 結晶サイズ分布のヒストグラム。エラーバーは標準偏差を示します、n = 55。

合成 Hz の PA および PT 特性評価後、GFP 発現 P. yoelii 17XNL を腹腔内に感染させた C57BL/6 マウスから血液サンプルを収集しました。透過（明視野）、蛍光、および PTM 技術を適用して、初期リングから成熟シゾントまでのさまざまな発生段階にある寄生虫を選択的に標的とするために、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した血液サンプル中の個々の細胞を画像化しました（図 7）。透過画像では、iRBC 内の寄生虫と Hz に関する構造情報がほとんど、あるいはまったく得られませんでしたが、蛍光 (FL) と PTM 共焦点プラットフォームを組み合わせると、RBC 内の自家蛍光と Hb 関連吸収バックグラウンドの間で、PI 標識された寄生虫と Hz がそれぞれ明確に区別されました。具体的には、統合された共焦点 PTM および共焦点 FL 顕微鏡により、P. yoelii に感染したマウス RBC における Hz と寄生虫の両方の共局在が良好な解像度と高い画像コントラストで示されました。 PTMにより、従来の透過顕微鏡では見ることができないHzとその凝集体の細胞内分布（図7b、c、図S4c〜e）を視覚化できました（図7a）。浸潤の 2 ～ 4 時間以内に、RBC の形状は従来の両凹円板からより小さな球形に変化しました。栄養型段階では、寄生虫はHb含有量をほぼ完全に消費し、複数のHzの結晶の形成を引き起こしました。これは、nRBCと比較してHbバックグラウンドが低下しているか、まったくないRBCで見ることができました（図7c、図S4c）。 PTMのみが、初期リング段階（図7a、b）から、RBCから血漿へのHzの放出を伴うシゾント段階（図S4f）までの寄生虫の進行の細胞間の詳細を監視することができました。一部の血液サンプルでは、Hz を摂取していない対照 (図 S4a) と比較して、摂取した Hz のある白血球 (図 7d) を観察することができました。

ヨウ化プロピジウム (PI) で染色したコントロールおよび P. yoelii 細胞に感染した細胞の光学画像。カラム: マウス血球の透過画像 (1 番目)、蛍光画像 (2 番目)、光熱顕微鏡 (PTM) (3 番目)、および統合画像 (4 番目)。 (a) 初期の環状段階 (感染後 2 ～ 4 時間)、赤血球内に 1 つの寄生虫が存在し、まだ Hz の兆候はありません。（b）1または数Hzで赤血球に単一の寄生虫が存在する栄養型段階（感染後6〜10時間）。 (c) 多くの寄生虫と Hz を伴う成熟したシゾント段階 (感染後 24 時間)。 (d) 寄生虫の兆候がない WBC の Hz、および RBC の Hz (感染後 24 時間)。

マウスのマラリアに関する我々の生体内と体外の両方での研究では、赤血球内のマラリア原虫由来の Hz を検出して解決する新しいレインボープラットフォームの能力を実証することに成功したため、次にヒトの病原体である熱帯熱マラリア原虫でレインボーサイトフォンをテストしました。熱帯熱マラリア原虫株 3D7 の凍結サンプルを、確立された複数ステップの手順 (方法を参照) を使用して解凍しました 23、24、25、26。感染後 0 ～ 12 時間のリングステージ寄生虫のみを含むように、寄生虫培養物を 5% ソルビトール溶液と同調させました。赤血球感染後の次の時点を含む、同期培養物から合計 9 個のサンプルが採取されました: 0 ～ 4 時間、6 ～ 10 時間、12 ～ 16 時間、18 ～ 22 時間、24 ～ 28 時間、30 ～ 34 時間、36 –40 時間、42 ～ 46 時間、および 48 ～ 52 時間。

非感染対照血液サンプルではシグナルは観察されませんでした（図5e）。 in vitroで培養した寄生虫を使用すると、iRBCにおける熱帯熱マラリア原虫誘発Hz（図5f、g）は、ex vivoでのP.ヨエリ感染RBC（図5b、d）よりも大きなPAシグナルを生成し、Cytophoneの有望な臨床的可能性を示しています。マラリアの診断。したがって、データは、固体レーザーをよりコスト効率が高く、より小型の多色レーザーダイオードに置き換えることがマラリア原虫の検出に適していることを示しています。

さまざまな赤血球ライフサイクル段階での熱帯熱マラリア原虫の出現を調査するために、PIで染色した血液中の培養サンプル中の個々の細胞に対して透過（明視野）、蛍光、およびPTM技術を再度採用しました（図S5）。画像は、RBC 浸潤前（a）、単一およびクラスター化 Hz の形成を伴う浸潤直後（4 時間以内）（b、c）、シゾントおよび Hz と思われる複数の寄生虫を含む成熟段階（感染後 24 時間）（d )、および内部に Hz を持つ放出された寄生虫のユニークなケース (e)。浸潤の初期段階（4 時間以内）で Hz 形成イベントを特定できたことは強調されるべきです。 PTM データは、3-D シミュレーション (図 S6) や 3-D 回転付きビデオ (補足ビデオ) でも提示でき、高解像度 PTM による Hz のより正確な空間位置特定が可能になります。 PTデータは、0〜4時間から48〜52時間までのさまざまな時点での熱帯熱マラリア原虫スライドの従来の染色とよく相関していました（図S7）。

この研究では、先進的なレーザーダイオードを備えた当社の2色Cytophoneが、Plasmodium-iRBCおよび関連する他のいくつかの固有PAマーカーの検出および同定のための新しい診断プラットフォームとしてさらなる開発の可能性があることを初めて実証しました。世界的に重要な他の病気も同様です。私たちは、2 つの小型レーザーダイオード (波長: 808 nm と 915 nm) を備えた Cytophone が、血液バックグラウンドとアーチファクトに対して、既知のすべての Plasmodium 種によって生成されるヘム分解副産物である Hz を識別できることを実証しました。非感染血液では、血液バックグラウンドを超える一時的な鋭いPAピークのないPA痕跡が得られましたが（図4b、5a、c、e）、最も蔓延し毒性の高いヒト種である体外培養熱帯熱マラリア原虫を含む、さまざまなマラリア原虫種に感染した血液では、、（図4d〜f、5b）は、通常のバックグラウンドに対する特定のPA信号比を持つHz関連ピークの2色（たとえば、808 nm / 915 nmまたは671 nm / 820 nm）識別の可能性を明確に示しています。他の比率の血液やアーチファクト、および/または通常 1 つの波長のみで生成される信号。 Hz の吸収スペクトルは、670 ± 2 nm でわずかに最大値を持つ NIR 範囲で波長の増加に伴って吸収が徐々に減少することを示しましたが、RBC の吸収はこの範囲 (たとえば、700 ～ 950 nm [図 1c]) でわずかに増加します 32。。寄生虫血症の定量データは、特定の時間の個々の iRBC に関連する時間単位あたりの PA 信号数 (つまり、信号速度) をカウントし、同じ時間に検出ポイントを通過した血液量で割ることによって取得できます。血液量を計算するための流量は、文献 15 から検査対象の血管について大まかに推定することも、US15 および/または PA 技術 9 によって直接測定することもできます。

さらに、PTM と PAFC の統合により、寄生虫 (メロゾイト) の赤血球侵入後わずか数時間 (4 時間) で形成される小さな (約 100 nm) 単一 Hz ナノ結晶と Hz 凝集体の検出が可能になることを実証しました (図.7、S4-6）。従来の検出技術を使用すると、Hz は 12 時間以上、最大 24 時間経過後にのみ検出可能であると考えられていました。磁気光学（MO）法のみが、6 ～ 10 時間の Hz 形成を検出できる可能性を実証しています 46。さらに、最近の分析 47 によれば、Hz 生合成の重要なステップである in vivo 結晶化速度は 7,000 ヘム/秒と推定されています。単一 Hz に約 600 万から 1000 万のヘムがあることを考慮すると、理論的には侵入後 15 ～ 24 分以内に Hz の形成が始まる可能性があります。私たちのデータが iRBC での Hz 形成のタイミングを遅らせた場合、侵入直後の初期の寄生虫の成長の生理機能と、48 年周期全体にわたる Hz の動態を理解するための高度な PTM および Cytophone プラットフォームの潜在的な有用性を再検討する必要があるかもしれません。 -h ライフサイクル。我々は、Cytophone が、低寄生虫密度と同様に、血液期感染の過程の早期にマラリアを診断する可能性を秘めている可能性があると同時に、in vivo での薬効と生存率の研究にも潜在的に役立つ可能性があることを示唆しています 23。

我々は、循環中の Hz の寿命が比較的長いこと（信号劣化なしで細網内皮系による顕著なクリアランスの最大 24 時間前）であることを発見しました（図 S2）。一方、他の薬剤（例、メラニン NP、黒色腫細胞、色素、細菌）は通常、はるかに短い時間（10 分から数時間）で除去されます9。生物学的に生成された Hz の動態はマウスとヒトのマラリアで研究されており、一度放出される Hz は急速に貪食され、細胞内 Hz は循環から出るまでこれらの食細胞に存在することが実証されました。特に、当社の統合されたマルチモーダルPAFFCプラットフォームにより、対応するシグナルの時間的一致を通じてiRBC内の寄生虫とHzの位置の特定、またはHzからの単一シグナルの存在を通じて血漿中の細胞外の特定が可能になります（図4g、5d）14。我々は、同じプラットフォームをiRBCのシゾント後破裂後の単球と好中球のHzの同定に使用でき、その後血漿中の遊離Hzの放出とその後の食細胞による貪食につながると信じています（図7d）。特に、好中球と単球は、それぞれ CD11 および CD15 マーカーに対する抗体で、または組み合わせて標識することによって識別できます。これらの使用は動物モデルを対象としていますが、将来的には、ヒトでのパイロット研究用に承認された結合型ICGまたは低毒性の金ナノ粒子20を、さまざまな血管区画におけるHzの局在化に使用できることが期待されています。さらに、これらのデータを活用して、赤血球内の Hz を遊離 Hz および貪食 Hz から区別するための in vivo PAFC 能力を最適化することを目指しています。一方で、遊離 Hz が循環から除去されるのにかかる時間はわずか 2、3 日であり 48、偽陽性のリスクが最小限に抑えられます。

前述したように、Cytophone プラットフォームは、空間的に走査するレーザービームを使用して、血管壁に付着した iRBC の空間分布を特定する可能性があります。私たちのデータは予備的なものですが、これは隔離として知られる、特に熱帯熱マラリア原虫におけるマラリアの病因の中心となるよく知られた現象を表しているのではないかと仮説を立てています。 iRBC の隔離は末梢血管系およびいくつかの組織で発生します。これはマウスおよびヒトの死後研究で広く説明されていますが、標識を使用せずに生体内でそのようなプロセスが発生することを示したデータは限られています。この分野では、静脈と動脈の iRBC 数の結果の比較など、さらなる研究が進行中です15。

おそらく、新しい Cytophone プラットフォームのさらなる開発において最も重要なのは、Plasmodium 種を区別するデバイスの能力でしょう。種が異なれば吸収スペクトルもわずかに異なる可能性があるため、適切なレーザー波長を選択することでマラリア原虫種を区別できる可能性があります。さらに、種が異なれば、異なる Hz ナノ結晶のサイズと形状が生成されます 33。 PA 信号の波形形状はターゲットのサイズに依存するため 2、3、これは異なる種を識別する別の方法である可能性があります。私たちはまださまざまなヒトのマラリア種に対して新しい Cytophone をテストしていませんが、私たちのデータは PAFC が最も重要なヒトの種である熱帯熱マラリア原虫を検出できることを決定的に示しています。実際、生成されたシグナルは、生体外のマウス P. yoelii サンプルからのものよりも強力であるように見えました。他の Hz ベースのデバイスが実証しているように、PAFC はすべての種を検出できると予想されており、上記のパラメーターに基づいて種を区別するための追加の研究が進行中です。

レインボー（つまり、マルチカラー）Cytophone は、現在利用可能な多くの 630 ～ 1650 nm の範囲の個別の波長を備えたマルチスペクトルレーザーダイオードと、時間色分けモード 9,19,20 を備えており、マルチカラー（最大 30 ～ 30同時に 40 色) 複数のターゲットの in vivo フローサイトメトリー。実際、この研究ではこの新しいプラットフォームをマラリアに適用しましたが、得られたデータ（例、図 3、4、5、S3）、および従来のレーザーを使用した以前に発表された結果 9、12、16、17、18、 19、20、21、43、44、45、46、49は、数mmのレーザーダイオードを備えた当社のCytophoneプラットフォームが、黒色腫、菌血症、鎌状赤血球貧血（例：、ヘモグロビン症）、脳卒中、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）関連合併症（凝固など）、オキシ型、デオキシ型、メタ型Hb（メトヘモグロビン血症）19を含むさまざまな形態のHb、および不十分な酸素輸送とサラセミアに関連するいくつかの血液疾患。レーザーダイオードは固体レーザーと比較して平均してパルスエネルギーが低いですが、Cytophoneの高感度と高度なソフトウェアおよび信号処理アルゴリズムにより、完全ではないにしても少なくとも部分的にこの制限が補償されます。さらに、最大 1 ～ 2 mJ37 のパルスエネルギーを備えた強力なレーザーダイオードアレイの開発の進歩により、臨床応用に対するこの制限の影響は大幅に軽減されるでしょう。ここで紹介する in vivo データは主にマウスのマラリアに限定されていますが、我々の有望な in vitro 熱帯熱マラリア原虫データにより、レインボーサイトフォンを用いたファーストインヒトパイロット研究を開始することができました。今後の研究では、プラスモディア属をバベシア属やバルトネラ属などの他の赤血球性病原体から検出/区別するサイトフォンの能力を評価する予定ですが、後者の2つがヘモゾインを産生することが知られていないことを考慮すると、これは達成可能であると予想されます。

我々は以前、PA信号（典型的な幅0.2～0.3μs）には、バックグラウンドと比較して、皮膚上のトランスデューサによって捕捉される血管内の循環物体からの明確に区別可能な音響時間遅延（0.5～2μs）があることを実証しました。色素沈着した皮膚層からの PA 信号 21。したがって、Cytophone の時間分解検出モードにより、PAFC 感度に対する皮膚の色素沈着の背景の影響を排除することができました。言い換えれば、このモードは、高速信号処理アルゴリズムと併せて、PA データを皮膚の色素沈着に耐性のあるものにします。さらに、生体内動物（図4a）と、プラスチックチューブとファントムの表面にメラニン層を備えた皮膚ファントム38で構成される血管ファントムモデルの両方を利用して、PAFC読み取り値に対する皮膚層の影響を評価しました。

結論として、マルチスペクトルの時間色分けパルスレーザーダイオードと高速時間分解信号処理を備えた Cytophone は、PA 技術、特に固体レーザーの使用に伴う PAFC の技術的複雑さによる以前の限界を克服します。サイズが大きく、コストが高く、ほとんどの用途で 1 つの波長が使用されます。私たちの予備的な結果は、レーザーダイオードを備えたポータブルで潜在的にバッテリーベースのCytophoneの実現可能性を実証しています。 Cytophone は、血液循環をリアルタイムで継続的に監視したり、定期的に検査したりして、侵入後数時間以内に寄生虫の出現を検出できます。 Cytophone の深さは、人間の比較的深い血管 (最大 3 ～ 5 cm) を評価する従来の in vivo PA イメージング技術の文書化された能力の範囲内に十分に収まっています2、3、4、5、6、7、8、9。しかし、顕微鏡や断層撮影プラットフォームを使用したこれらの技術は比較的遅いため、特に深く大きな血管内で、高速移動（深さ 1 mm の血管でも 3 ～ 10 cm/s）、循環する iRBC、およびその他のターゲットを検出することが困難になります。高パルス繰り返し固体レーザーと今回のレーザーダイオードを使用した以前のデータは、音響分解能を備えた PAFC ベースの Cytophone プラットフォームが、比較的深いところ (1 ～ 2 cm) で循環するさまざまな起源の物体の高速検出とスペクトル識別を提供できることを示唆しています。最大流速 10 ～ 20 cm/s の大きな (4 ～ 6 mm) 血管 9,12,21。すべてのプラスモディア属種の中心である Hz 形成のプロセスをターゲットにしながら、そのような血管を調査する独自の能力は、非常に迅速で非侵襲的、ラベルフリーの汎種マラリア診断の可能性をもたらします。サイトフォンの感度により、大量の循環血液をスクリーニングできるという利点を利用して、無症状者の大規模な貯蔵庫の検出がさらに可能になる可能性があり、これはマラリア制御の改善と最終的な撲滅の両方に向けて前進するのに役立つ可能性があります。さらに、この研究のデータと私たちの以前の PAFC の研究を組み合わせることで、マルチカラー Cytophone プラットフォームにより複数の疾患の検出と特定が可能になり、広範囲にわたる世界的な環境において有望なポータブル非侵襲ツールとなる可能性があると我々は予想しています。

マルチカラー PAFC ベースの Cytophone セットアップ (図 1a、2a ～ c) には、波長 808 nm および 915 nm (図 2c)、パルス幅27 ns、パルス繰り返し率 1 ～ 3 kHz、パルスエネルギーはそれぞれ 140 μJ と 110 μJ です。各レーザーには、全長 5 mm、個々のエミッターサイズ 8 × 200 µm のエミッターが 20 個あります。どちらのレーザーダイオードも、光学部品を追加することなく、いわゆる「速軸」で 40 度、「遅軸」で 10 度の出力発散角を持っていました 37,38 。速軸方向の発散角を約 2 度に減少させるため、これによりレーザー放射をコリメートするために、焦点距離 260 μm、直径 400 μm の速軸コリメータ (FAC) レンズが追加されました。 2 つのミラーを使用して、レーザー放射を同じ伝播方向に結合しました。 1 つのミラーは銀 (PF10-03-P01、Thorlabs Inc) で、ダイクロイックミラー (Di02-R830-25 × 36、Semrock、IDEX Health & Science、 LLC）。結合されたレーザービームは、球面レンズ (LA1274-B、焦点距離 40 mm、Thorlabs Inc.) とそれに続く非球面円筒形コンデンサー (ACL2520-B、焦点距離 20 mm、Thorlabs Inc.) によって集束線形ビームにさらに変換されました。。）。最終的なレーザービームのサイズは 1.8 mm × 65 μm で、CMOS カメラ (DCC1645C-HQ、Thorlabs, Inc.) で定期的に制御されました。光学系を出た後のパルスエネルギーは 80 μJ に調整されており、これは私たちのアプリケーションには十分でした。レーザーエネルギーは、光パワーメーター PM100USB、S314C センサー (Thorlabs, Inc.) を使用して制御されました。

サンプル内のレーザー誘起音響波は、特注の集束円筒形トランスデューサー (中心周波数: 51.1 MHz、焦点距離 6 mm、横方向音響分解能 65 μm) で検出されました。トランスデューサは独立した XYZ 位置決めステージに固定されており、その位置をマイクロメートル精度で調整できます。独立した Z ステージを使用して光学レンズを Z 方向に調整し、PA 信号の振幅を最大化しました。両方のレーザーダイオードから等しい PA 信号を取得するために、最初に両方のレーザーダイオードのエネルギーのバランスをとり、次に独立した Z ステージを使用して、ステージを Z 方向に移動することで音響および光学の焦点に最適な点でサンプルを調整しました。その結果、両方のレーザーダイオードの波長で同様の吸収を持つ物体 (黒いテープなど) からの等しい最大 PA 信号が達成されました。従来の超音波ゲルが音響結合に使用されました。標準パルス発生器を利用してレーザーダイオードを駆動する信号を生成し、その結果得られた同期信号がデータ収集ボード (ATS9350、Alazar Technologies, Inc.、カナダ) に送信されました。 PA 信号はプリアンプ (AH-2010–100、Precision Acoustics Ltd、英国) によって増幅されました。

PAFC モジュールと FFC モジュールを統合する PAFFC の原理については、他の場所で詳しく説明されています14。簡単に説明すると、このセットアップは、対応する波長 532 nm、671 nm の 3 つの高パルス繰り返しレート (1 ～ 10 kHz) ナノ秒 (0.6 ～ 8 ns) レーザーを備えた Nikon Eclipse E400 (Nikon Instruments Inc.、米国) 顕微鏡プラットフォーム上に構築されました。 PA 検出には nm、820 nm、1060 nm、および 1064 nm、蛍光検出には CW488 nm レーザーダイオードを使用します。波長 1,060 nm、パルスレート 1 ～ 10 kHz、パルス幅 0.8 ～ 10 ns で動作する Yb ファイバーレーザー YLPM-0.3-A1-60–18 (IPG Photonics Corp.) を使用しました。レーザーエネルギーはパワーメーター（PM100USB、S314Cヘッド、Thorlabs, Inc.）で制御しました。光検出器 (PDA10A、150 MHz、Thorlabs, Inc.) からの信号がデータ収集ハードウェアをトリガーしました。レーザー光線を動物モデルのファントムまたは実際の血管を横切る細い線（6.5 μm × 780 μm）に形成するために、非球面レンズ（C560TME-C）と円筒レンズ（LJ1598-L1-C）の組み合わせを使用しました（ Thorlabs, Inc.）。

レーザー誘起音波は、0.2 ～ 32 MHz の範囲の広帯域周波数応答、焦点距離 6 mm の 28 µm ポリフッ化ビニリデン感圧素子を備えたカスタムの円筒集束超音波トランスデューサーによって検出されました。トランスデューサは、正確な位置調整を可能にするために XYZ ステージに取り付けられました。 PC を利用してトランスデューサー信号を記録し、増幅器 (モデル 5662B、50 kHz ～ 4 MHz、Panametrics) によって増幅しました。 LabVIEW および MATLAB ソフトウェアだけでなく、アナログ - デジタルコンバータボードによって、信号を収集するためのセットアップが可能になりました。光電子増倍管からの蛍光シグナルは、4 MHz のレートでサンプリングされ、平均 400 ポイントで 10 kHz にダウンサンプリングされました。カスタマイズされたソフトウェアを使用して両方の信号を分析し、バックグラウンドレベルよりも高い各ピークの出現時間、振幅、形状、幅を示す信号トレースとして表示されました。

PTM システムの一般原理は、他の場所で詳細に説明されています 34、35、36。簡単に説明すると、共線デュアルビーム (ポンププローブ) 共焦点 PTM イメージングの技術プラットフォームは、異なる高パルスレート (1 ～ 10 kHz) を備えた IX73 顕微鏡プラットフォーム (Olympus America, Inc.、ペンシルベニア州セントラルバレー) に基づいていました。、固定波長 (532/671/820/1064 nm) のナノ秒 (5 ～ 10 ns) レーザーで、レンズと光ファイバーを組み合わせてレーザー光をサンプルに照射します。これは、473 nm CW レーザー (蛍光励起用)、532 nm CW およびパルスレーザー (PT ポンピングおよび蛍光用) からのビームを組み合わせた 3 波長波長分割マルチプレクサー (WDM-RGB46HF、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州) を使用して達成されました。励起)、および 635 nm CW レーザー (PT プローブ) をシングルモードファイバーに送ります。アプリケーションに応じて、この回路図を使用すると、システムのアライメントを損なうことなく、PT イメージング用のパルスレーザーソースと CW ポンプレーザーソースを切り替えることができます。まず、532 nm で動作する CW レーザーを使用した従来のポンピング回路図を使用しました。レーザー強度は、電気光学変調器 (EOM-NR-C4、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州) を使用して 100 kHz の周波数で変調されました。ポンピングレーザー光の吸収に起因する PT 現象は、ロックイン増幅器を備えたフォトダイオード (SR530、Stanford Research Systems、カリフォルニア州サニーベール) を使用したプローブビーム強度の変調によって検出されました。次に、532 nm パルスレーザー (モデル、LUCE 532、パルス幅、5 ns、パルスレート、10 ～ 30 kHz、Bright Solutions、イタリア) を使用して、サンプルに線形および非線形 PT 効果を誘発しました。このレーザーの強度は同じ電気光学変調器を介して変調され、PT 信号をフィードバックとして使用してパルス間のパルスエネルギーを迅速に変更し、サンプルの損傷を防ぎました。共焦点 PT 構成を実現するために、光検出器のピンホールは、プローブビームの「ウエスト面」から 1 レイリー範囲離れた面に配置されました。したがって、ピンホールにより、焦点が合っていない PT 信号の影響を排除しながら、個々の吸収ターゲット内の高度に局所的な熱レンズ効果の検出が可能になります。 3D イメージングの場合、z 軸に沿って分布する平行な x-y 平面上で連続した PT 画像が取得されました。 PT データを検証し、システムをより汎用的にするために、共焦点 PTM と共焦点蛍光顕微鏡モジュールを使用し、蛍光とプローブビームおよびマルチモーダル PT 蛍光の空間選択に同じピンホールを使用することで、PTM を PA、透過、および蛍光の方法と統合しました。造影剤。特に、蛍光モジュールは、細胞の自己蛍光と、細胞質および膜の P. yoelii 17X GFP + 感染 RBC からのレーザー誘起蛍光を取得するために使用されました (532 nm 励起レーザーを使用した 575/15 nm チャネルを使用)。

この研究では、EDS システム (ニュージャージー州マーワーの EDAX Inc) を備えた電界放出型電子銃を備えた JSM-7000F SEM (JEOL USA、マサチューセッツ州ピーボディ) を使用しました。 SEM イメージングでは、2 つのサンプル前処理方法が利用されました。 1) Hz 結晶の乾燥粉末をエタノール溶液に懸濁しました。数滴の懸濁液を 12.2 (直径) × 10 mm (厚さ) のアルミニウムディスク (Ted Pella, Inc、カリフォルニア州レディング) 上に置き、2) 同じ乾燥粉末を穴の開いたカーボンコーティングされた TEM 上に振りかけました。グリッド (SPI Supplies、ペンシルバニア州ウェストチェスター)。 TEM 画像は、EDAX EDS システムも装備された電界放射型電子銃 (JEOL USA、マサチューセッツ州ピーボディ) を備えた JEM-2100F によって収集されました。 Hz 結晶をエタノールに懸濁し、穏やかに振盪して注意深く分散させました。数滴の Hz 懸濁液を、穴のあいたカーボンコーティングされた 200 メッシュの銅 TEM グリッド (SPI Supplies、ペンシルベニア州ウェストチェスター) 上に堆積させました。これらのグリッドは、TEM 分析の前に 1 時間乾燥させました。

動物は、アーカンソー医科大学 (UAMS) 施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って使用されました。雌の C57BL/6 および Foxn1(nu/nu) マウス (The Jackson Laboratory, Inc.) に、腹腔内注射により 105 血期の Plasmodium yoelii 17XNL GFP+ 寄生 RBC を感染させました。未感染のC57BL/6マウスを陰性対照として使用した。実験中、マウスは 1.2% イソフルランの吸入によって麻酔され、in vivo モニタリングのために 37 °C の加熱ステージ上に仰向けに置かれました。研究のために選択された血管は、マウスの耳の深さ 150 ～ 200 μm で直径約 50 ～ 70 μm でした。トランスデューサーと光学チップは、検出点の皮膚の上にそっと配置され、最大かつ安定した PA 信号が得られるように位置合わせを最適化することでリアルタイムで調整されました。超音波ゲル (Aquasonic Clear、Parker Labs, Inc.) をトランスデューサーと皮膚の間の音響結合に使用しました。薄い血液塗抹標本のギムザ染色および蛍光顕微鏡を使用したインビトロ試験のために、マウスの血液を尾血管から採取した。 PAFFC (上) の場合、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含む 28G 針と 1 cc 注射器を使用して、麻酔をかけたマウスの尾の腹側動脈と側静脈から血液を採取しました。健康なマウスと感染したマウスから採取し、100% メタノールで固定し、空気乾燥させた血液サンプルを使用して、血液塗抹標本を調製し、スライドガラス上で検査しました。マウスをGFP発現寄生虫に感染させ、非感染マウスを対照として使用した。血液寄生虫の段階を推定するために、1 秒あたりの PA シグナル数を分析しました。

選択された実験では、イェール大学治験審査委員会によって承認されたプロトコールに従って、ボランティアからのヒト血液が使用されました。すべての被験者からインフォームドコンセントを得た。すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

流れる光吸収物体の in vitro PA 検出は、社内で構築された動的血流血管ファントムで実行されました 38,39。これは、適切な散乱特性と吸収特性を備えた生体組織をモデル化した TiO2 ナノ粒子を含むポリ塩化ビニルプラスチゾル、色素沈着した皮膚を表すメラニン層、異なる直径と深さのガラスとプラスチックのチューブ、および 0.5 ～ 5 cm の速度で動く物体を送り出すフローモジュールで構成されていました。 /秒。特に、深さ 0.5 ～ 2 mm の血管として機能する直径 0.78 mm の円筒ガラス管 (Sutter Instrument、BF100-78-10) は、PAFC の典型的な医療用途をモデル化しました。流れる細胞と粒子を模倣するために、1) 異なるサイズと NIR 範囲の比吸収を持つ磁気ビーズを使用しました (図 1c)。 2) 血液中の赤血球凝集体を表す赤い CBC。 3) 白色 CBC ファントムとしての 100 μm 透明シリカビーズ。 4 ICG 凝集体は 808 nm を優先的に吸収します。 5) 市販の Hz。具体的には、10 μg/mL、1.0 μg/mL、および 0.1 μg/mL の濃度の PBS 溶液中の合成 Hz 懸濁液を、色素皮膚および iRBC のファントムとして使用しました。ＰＢＳ中のＨｚ懸濁液は、製造元（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の指示に従い、元のバイアル中の５ｍｇのＨｚ結晶に１ｍＬのＰＢＳを添加することにより、５ｍｇ／ｍＬのストック懸濁液から得た。ＰＡＦＣシステムを校正するために、異なる平均直径を有する磁気ビーズ（ＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈＩｎｃ．）の投与後の痕跡も監視した。同量 (2 μL) の磁気ビーズ懸濁液 (異なる平均粒径分布: 5.25 μm、8.22 μm、および 23.7 μm の 1% w/v) を 8 mL の PBS に懸濁しました。

ネズミの研究。 PAFFC プラットフォームを使用して、非致死性げっ歯類の Plasmodium 種 P. yoelii 17XNL (MR4、BEI Resources Repository) を使用して、生体外でネイティブ Hz の早期検出を試みました。 ex vivo リアルタイム Hz 検出の二次検証を提供するために、緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグ付き寄生虫株 (P. yoelii 17XNL:PyGFP) が使用され、PAFFC プラットフォームで蛍光チャネルの利用が可能になりました。感染後 3 ～ 4 時間で採取した Foxn1(nu/nu) マウスからの感染血液を、PAFFC 手順と同時に、顕微鏡による薄い血液塗抹標本スライド検査によって分析しました。具体的には、GFP+ P. yoelli に感染した血液サンプル 100 μL を、ヘパリンチューブ内の RPMI 1640 培地 100 μL で希釈しました。この溶液の 1 µL サンプルを、次の比率 1:102、1:103、1:104、および 1:105 で PBS でさらに連続希釈し、各希釈サンプルを 671 nm のパルスレーザーを使用して PAFFC によって分析しました。 PA 励起と 473 nm の CW レーザーによる蛍光励起。

熱帯熱マラリア原虫（実験株 3D7）の凍結サンプルを、複数段階の生理食塩水手順を使用して解凍しました（BEI Resources、バージニア州マナッサス）。熱帯熱マラリア原虫のプレートを、ヒト赤血球とともに２％ヘマトクリットで連続培養し、５％二酸化炭素および１％酸素の雰囲気下、補充ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃でインキュベートした。寄生虫培養物が > 5% 寄生虫血症に達したら、感染後 0 ～ 12 時間の環状ステージ寄生虫のみを含めるように、それらを 5% ソルビトール溶液で同調させました。これらの培養プレートは、寄生虫が後期シゾント段階に達するまで監視され、その時点で 60% パーコール勾配を使用してシゾント段階の寄生虫を分離しました。収集したシゾント寄生虫を、感染していないヒト赤血球を含む新しい培養プレートに再導入し、4 時間インキュベートしました。これらの熱帯熱マラリア原虫培養物を 5% ソルビトール溶液と同調させて、感染後 0 ～ 4 時間のリングステージ寄生虫のみを含むプレートを作成しました。同期した熱帯熱マラリア原虫培養物を次の 48 時間モニタリングし、6 時間ごとに連続的に培養物をサンプリングして、分析用の薄い血液塗抹標本および厚い血液塗抹標本顕微鏡スライドを調製しました。赤血球感染後の次の時点を含む、同期培養物から合計 9 個のサンプルが採取されました: 0 ～ 4 時間、6 ～ 10 時間、12 ～ 16 時間、18 ～ 22 時間、24 ～ 28 時間、30 ～ 34 時間、36 –40 時間、42 ～ 46 時間、および 48 ～ 52 時間。

寄生虫血症の段階に応じて、マウスを 1 ～ 3 日ごとに 10 分から 1 時間まで in vivo でモニタリングしました。 PA 信号速度は、時間単位 (秒または分) ごとの信号数として計算されました。血管のサイズ、日々のモニタリングの位置、およびマウスの個体差によるデータの変動を均等化するために、マウスの耳内の直径約 50 μm の同様の血管を選択して使用しました。次に、PA 波形のピークツーピーク振幅を追跡し、バックグラウンドレベルより少なくとも 3σ 高い点を PA 信号とみなしました。すべての測定は少なくとも 3 回実行され、これらすべてのデータポイントの平均が図にプロットされました。収集したデータ (M カウント) を M ± SD としてプロットしました。信号および統計解析は MATLAB (MathWorks, Inc.) で実行されました。標準誤差バーを使用して収集したデータの平均を計算し、比較には α = 0.05 の有意水準を採用しました。

この研究に関連するすべてのデータは、論文または補足資料に記載されています。

Yun, SH & Kwok, SJJ 診断、治療、手術が得意。ナット。バイオメッド。工学 https://doi.org/10.1038/s41551-016-0008 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Omar, M.、Aguirre, J. & Ntziachristos, V. 生物医学のための光音響メゾスコピー。ナット。バイオメッド。工学 https://doi.org/10.1038/s41551-019-0377-4 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

スタインバーグ、I. et al. 光音響臨床イメージング。光音響 https://doi.org/10.1016/j.pacs.2019.05.001 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Taruttis, A. & Ntziachristos, V. リアルタイムのマルチスペクトル光音響イメージングとそのアプリケーションの進歩。ナット。フォトニクス https://doi.org/10.1038/nphoton.2015.29 (2015)。

記事 Google Scholar

Knieling, F. et al. クローン病の活動性を評価するためのマルチスペクトル光音響トモグラフィー。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. https://doi.org/10.1056/nejmc1612455 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

エルミロフ、SA et al. 乳がんを検出するためのレーザー光音響イメージングシステム。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 https://doi.org/10.1117/1.3086616 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Schoustra、SM et al. Twente 光音響マンモスコープ 2: システムの概要と健康な乳房の 3 次元血管網画像。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 https://doi.org/10.1117/1.jbo.24.12.121909 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Petrov、YY、Petrova、IY、Patrikeev、IA、Esenaliev、RO & Prough、DS 脳静脈酸素化の非侵襲的モニタリングのための多波長光音響システム: 内頸静脈におけるパイロット臨床試験。オプション。レット。 https://doi.org/10.1364/ol.31.001827 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Galanzha, E. & Zharov, V. in vivo および ex vivo での光音響フローサイトメトリーによる循環腫瘍細胞の検出と捕捉。キャンサーズ（バーゼル）。 https://doi.org/10.3390/cancers5041691 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Heidrich, I.、Ačkar, L.、Mossahebi Mohammadi, P.、Pantel, K. リキッドバイオプシー：可能性と課題。内部。 J. Cancer https://doi.org/10.1002/ijc.33217 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Steenbergen, W. & Zharov, VP in vivo フローサイトメトリーとセラノスティクスによる総血液量の達成に向けて。サイトメトリー A https://doi.org/10.1002/cyto.a.23916 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Tuchin, VV、Tárnok, A. & Zharov, VP In vivo フローサイトメトリー: チャンスの地平線。サイトメトリー A https://doi.org/10.1002/cyto.a.21143 (2011)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartmann, C.、Patil, R.、Lin, CP & Niedre, M. in vivo での単一循環細胞の蛍光検出、計数および特性評価: 技術、応用、および将来の展望。物理学。医学。バイオル。 https://doi.org/10.1088/1361-6560/aa98f9 (2018)。

記事 Google Scholar

Cai、C.ら。マラリアの早期診断のための生体内光音響フローサイトメトリー。サイトム。パート A https://doi.org/10.1002/cyto.a.22854 (2016)。

記事 Google Scholar

メンヤエフ、YAら。前臨床光音響モデル: 大静脈および動脈における超高感度単細胞マラリア診断への応用。バイオメッド。オプション。エクスプレス https://doi.org/10.1364/boe.7.003643 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マサチューセッツ州ジュラトリら。集束光音響プローブを使用した、深部血管内の循環白血栓と赤血栓の非侵襲的ラベルフリー検出。バイオメッド。オプション。エクスプレス https://doi.org/10.1364/boe.9.005667 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai、C.ら。 in vitro および in vivo での単一鎌状赤血球検出のための光音響フローサイトメトリー。アナル。細胞。パソル。 https://doi.org/10.1155/2016/2642361 (2016)。

記事 Google Scholar

ノーラン、J.ら。循環腫瘍関連エキソソームの in vivo フローサイトメトリー。アナル。細胞。パソル。 https://doi.org/10.1155/2016/1628057 (2016)。

記事 Google Scholar

Brusnichkin、AV et al. 熱レンズ分光法によるさまざまなヘモグロビン種の測定。モスクワ大学化学。ブル。 https://doi.org/10.3103/s002713140901009x (2009)。

記事 Google Scholar

ガランザ、EIら。循環腫瘍細胞の in vivo 磁気濃縮と多重光音響検出。ナット。ナノテクノロジー。 https://doi.org/10.1038/nnano.2009.333 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ガランザ、EIら。 Cytophone プラットフォームを使用した、黒色腫患者の循環腫瘍細胞の光音響検出のための in vivo リキッドバイオプシー。科学。翻訳。医学。 https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat5857 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

誰が。世界マラリア報告書 2021。世界保健機関。世界保健機関 (2021)。

Wongsrichanalai, C.、Barcus, MJ、Muth, S.、Sutamihardja, A. & Wernsdorfer, WH マラリア診断ツールのレビュー: 顕微鏡検査と迅速診断検査 (RDT)。午前。 J.トロップ。医学。ヒュグ。 77、119–127 (2007)。

記事 Google Scholar

Delahunt, C.、Horning, MP、Wilson, BK、Proctor, JL & Hegg, MC 暗視野顕微鏡を使用したヘモゾインベースの熱帯熱マラリア原虫診断の限界。マラー。 J. https://doi.org/10.1186/1475-2875-13-147 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワイス、GEら。熱帯熱マラリア原虫の赤血球侵入時の受容体リガンド相互作用の配列とその結果として生じる細胞形態を明らかにします。 PLoS 病巣。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004670 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Burnett, JL、Carns, JL & Richards-Kortum, R. マラリアの無針診断に向けて: ヘモゾインを含む赤血球と白血球の生体内同定と分類。マラー。 J. https://doi.org/10.1186/s12936-017-2096-1 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Rebelo、R. et al. 蒸気ナノバブルを用いたマラリアの経皮診断。出現。感染する。ディス。 https://doi.org/10.3201/eid2202.151203 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Schloetel, JG、Heine, J.、Cowman, AF、Pasternak, M. ガイド付き STED ナノスコピーにより、血液段階のマラリア原虫の超解像度イメージングが可能になります。科学。代表者 https://doi.org/10.1038/s41598-019-40718-z (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Frita, R. et al. 診断、免疫学、薬剤感受性検査の研究のための、白血球と赤血球を含むヘモゾインのシンプルなフローサイトメトリー検出。マラー。 J. https://doi.org/10.1186/1475-2875-10-74 (2011)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Rifaie-Graham、O. et al. マラリア診断のためのアッセイとしてのヘモゾイン触媒沈殿重合。ナット。共通。 https://doi.org/10.1038/s41467-019-09122-z (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pagola, S.、Stephens, PW、Bohle, DS、Kosar, AD & Madsen, SK マラリア色素 β ヘマチンの構造。自然 https://doi.org/10.1038/35005132 (2000)。

論文 PubMed Google Scholar

Lee, MSJ、Igari, Y.、Tsukui, T.、Ishii, KJ & Coban, C. 合成ヘモゾインアジュバントの現状: 予備的な安全性評価。ワクチン https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2016.02.064 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Noland, GS、Briones, N. & Sullivan, DJ ヘモゾイン結晶の形状とサイズにより、さまざまなマラリア原虫種が区別されます。モル。生化学。パラシトール。 https://doi.org/10.1016/S0166-6851(03)00163-4 (2003)。

論文 PubMed Google Scholar

アンジン、ＶＢら。フッ化水素分子による吸収の光音響検出における調整可能な Ga As レーザーの使用。 Sov J 量子電子 https://doi.org/10.1070/QE1975v005n07ABEH011418 (1975)。

記事 Google Scholar

Allen, TJ & Beard, PC 生物医学の光音響イメージング用のパルス近赤外レーザーダイオード励起システム。オプション。レット。 https://doi.org/10.1364/ol.31.003462 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Kolkman, RGM、Steenbergen, W. & Van Leeuwen, TG パルスレーザーダイオードを使用した血管の生体内光音響イメージング。レーザー医学。科学。 https://doi.org/10.1007/s10103-006-0384-z (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Zhong, H.、Duan, T.、Lan, H.、Zhou, M.、Gao, F. レーザーダイオードと発光ダイオードに基づく低コストの光音響センシングとイメージングのレビュー。センサー (スイス) https://doi.org/10.3390/s18072264 (2018)。

論文 PubMed Central Google Scholar

Jawad, HJ、Sarimollaoglu, M.、Biris, AS & Zharov, VP ネガティブおよびポジティブの光音響コントラストを備えた動的血流ファントム。バイオメッド。オプション。エクスプレス https://doi.org/10.1364/boe.9.004702 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

コズロバ、A.ら。 in vivoリキッドバイオプシー標準化のための動的血流ファントム。科学。議員 https://doi.org/10.1038/s41598-020-80487-8 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nedosekin, DA、Galanzha, EI、Ayyadevara, S.、Shmookler Reis, RJ & Zharov, VP 複数の細胞発色団および蛍光団の光熱共焦点分光顕微鏡。生物物理学。 J. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2011.12.035 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nedosekin, DA、Galanzha, EI、Dervishi, E.、Biris, AS & Zharov, VP 超解像度非線形光熱顕微鏡。小 https://doi.org/10.1002/smll.201300024 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Nedosekin, DA、Shashkov, EV、Galanzha, EI、Hennings, L. & Zharov, VP 無傷の、染色された、選択的に焼かれた組織におけるナノ粒子と微小転移の定量的組織学のための光熱マルチスペクトル画像サイトメトリー。サイトム。パート A https://doi.org/10.1002/cyto.a.20977 (2010)。

記事 Google Scholar

Brusnichkin、AV et al. ミトコンドリア、生細胞、および溶液中のシトクロム c の超高感度ラベルフリー光熱イメージング、スペクトル同定、および定量化。 J. バイオフォトニクス https://doi.org/10.1002/jbio.201000012 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zharov, VP、Galanzha, EI & Tuchin, VV In vivo 光熱フローサイトメトリー: 血液およびリンパ流中の個々の細胞のイメージングと検出。Ｊ．Ｃｅｌｌ．生化学。 https://doi.org/10.1002/jcb.20766 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Zharov, VP、Galanzha, EI & Tuchin, VV 個々の移動細胞の検出とイメージングのための in vitro 光熱フローサイトメトリー。サイトメトリー A https://doi.org/10.1002/cyto.a.20384 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

モルナール、P. et al. ヘモゾインの磁気光学検出による迅速かつ定量的な抗マラリア薬の有効性試験。科学。議員 https://doi.org/10.1038/s41598-020-70860-y (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kapishnikov, S.、Hempelmann, E.、Elbaum, M.、Als-Nielsen, J. & Leiserowitz, L. マラリア色素の結晶：マラリア原虫のアキレス腱。化学。医学。化学。 https://doi.org/10.1002/cmdc.202000895 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Memeu, DM、Sallorey, AM、Maina, C. & Kinyua, DM 光音響マラリア診断技術のレビュー。 J. クリンを開きます。診断 11、59–75 (2021)。

記事 Google Scholar

ガランザ、EIら。負の光熱コントラストおよび光音響コントラストを使用した循環血餅の in vivo フローサイトメトリー。サイトム。パート A https://doi.org/10.1002/cyto.a.21106 (2011)。

記事 Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は UAMS 寄付基金によって部分的に支援されました。カスタマイズされた集束円筒形および球形トランスデューサを提供してくださった I. Pelivanov (ワシントン大学) に感謝します。熱帯熱マラリア原虫の培養と同期プロトコルの支援については、Amy Bei (イェール公衆衛生大学院) に感謝します。 Plasmodium yoelii 株 17XNL:PyGPF は、Ana Rodriguez の寄稿により、BEI Resources、NIAID、NIH、MRA-817 を通じて入手されました。レーザーダイオードの初期テストを手伝ってくれた Sergey Nikitin に感謝します。ほとんどの実験研究は UAMS で行われ、一部はイェール大学で行われました。この研究を達成した後、HJJ はイラク、バグダッドのアル・ジャドリヤにあるバグダッド大学物理学科に移りました。

次の著者も同様に貢献しました: Hind J. Jawad と Aayire C. Yadem。

この作品は、Sunil Parikh と Vladimir P. Zharov の著者が共同で監修しました。

統合ナノテクノロジー科学センター、アーカンソー大学リトルロック校、2801 S. University Ave.、リトルロック、アーカンソー州、72204、米国

ハインド・J・ジャワド、アイレ・C・ヤデム、渡辺フミヤ、アレクサンドル・S・ビリス

アーカンソーナノ医療センター、アーカンソー医科大学、4301 W. Markham St.、リトルロック、アーカンソー州、72205、米国

ハインド・J・ジャワド、アイレ・C・ヤデム、ユリアン・A・メンヤエフ、ムスタファ・サリモラオグル、ドミトリー・ネドセキン、ウラジミール・P・ザロフ

バグダッド大学物理学科、アル・ジャドリヤ、バグダッド、10071、イラク

ハインド・J・ジャワド

Yale School of Public Health、60 College St、New Haven、CT、06520、米国

ジリアン・N・アームストロング & スニル・パリク

微生物学および免疫学部、アーカンソー医科大学、4301 W. Markham St.、リトルロック、アーカンソー州、72205、米国

ジェイソン・S・スタムホーファー

アーカンソー医科大学医学部、アーカンソー州リトルロック、72205、米国

ドミトリー・ネドセキン

アーカンソー医科大学医学部耳鼻咽喉科、リトルロック、アーカンソー州、72205、米国

ジェームズ・Y・スエン & ウラジミール・P・ザロフ

CytoAstra, LLC、401 South Cedar St.、リトルロック、アーカンソー州、72205、米国

ジェームズ・Y・スエン & ウラジミール・P・ザロフ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

VPZ は研究を計画し、論文を執筆しました。 HJJ、ACY、YAM、JYU は技術プラットフォームを開発しました。 MS はソフトウェアと信号処理を開発しました。 HJJ、ACY、YAM は PA 関連の研究を実施。 ACYとDNはPT関連の研究を実施した。 JSS はマラリア動物モデルを提供し、JNA と SP はヒト関連サンプルと関連評価を提供しました。 FW と ASB はサンプルの特性評価を実施しました。 SPが論文を編集した。著者全員が論文を読み、最終版に同意しました。

ウラジミール・P・ザロフへの通信。

VPZ、JYS、および UAMS は、この出版物で説明されているテクノロジーに金銭的利益を持っています。 VPZ と JYS は両方とも、この研究成果で紹介された技術のライセンスを取得した CytoAstra, LLC に金銭的利益を持っています。これらの金銭的利益は、UAMS の利益相反ポリシーに従って審査され、承認されています。他の著者には、この原稿に関して利益相反はありません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ S1。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

ジャワド、HJ、ヤデム、AC、メンヤエフ、YA 他世界的な疾病診断のためのレーザーダイオードを搭載したレインボーポータブルサイトフォンを目指して。 Sci Rep 12、8671 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 10 月 6 日

受理日: 2022 年 4 月 18 日

公開日: 2022 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。