SARS の超高速不活化 | 河北レーザーマーキング株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18640 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

消毒は病原微生物を除去し、人間にとって生物学的に安全な環境を確保します。新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の急速な蔓延により、有害な副作用を軽減し、より迅速なプロセスを実行するという点で、従来の消毒方法が困難になっています。大規模な化学消毒剤の噴霧は個人や環境に有害ですが、UV ランプや発光ダイオード (LED) による消毒は、放射照度が低く、ビームの発散性が高いため、依然として長時間の曝露が必要です。レーザーは長距離にわたって高い放射照度を維持するため、新しい消毒方法としてレーザーの有効性を研究しました。その結果、266 nm レーザーで SARS-CoV-2 ウイルスを超高速に不活化できることがわかりました。この研究により、UV レーザーが消毒に適していることが確認されました。

新型コロナウイルス SARS-CoV-2 は、世界中に広がる深刻な呼吸器疾患を伴うパンデミックの原因です。 2022 年 3 月 5 日の時点で、新型コロナウイルス感染症の感染者数は 4 億 4,000 万人以上確認され、590 万人以上の死亡が報告されています1。新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に対するワクチンと治療薬の開発が広く成功裏に行われているにもかかわらず、パンデミックは依然として山火事のように広がっています。新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) のようなパンデミック感染症に対して、感染経路を断つことが依然として最も効果的な解決策であることに人々は気づいています2。

SARS-CoV-2 の主な感染経路は、エアロゾル 3 または接触 4 です。 SARS-CoV-2 粒子はエアロゾル中で最大 3 時間検出可能であると報告されています5。したがって、人間と暖房、換気、空調 (HVAC) システムの空気交換エアロゾル間の部屋間での近距離エアロゾル感染は、ウイルス拡散の観点から危険です 6、7、8、9、10。一部の研究グループや機関は、エアロゾル感染が新型コロナウイルス感染症パンデミックの主要な経路として認識されつつあると信じており、そのことは研究研究3や世界保健機関（WHO）の声明11で示されている。

化学物質は有毒であるか空気中で引火性があるため、従来の化学的手法はこのようなエアロゾルのシナリオには適用できません。たとえば、医療用アルコールは消毒に適していますが、アルコールを大量に噴霧すると火災や爆発を引き起こす可能性があります。別の例として、過酸化水素、オゾン、塩素系漂白剤などの化学薬品も消毒には適していますが、人体に有毒であるため、人の周囲に大量に噴霧するのには使用すべきではありません。したがって、周囲に人がいるときに空気を消毒するために化学物質を噴霧することは、いかなる状況であっても推奨されません12。

特に HVAC システムの場合、高速空気流条件下でエアロゾルを迅速に消毒できる既知の方法はありません。セントラル空調システムを例にとると、空気流速は通常 20 ～ 30 m/s13 です。したがって、セントラル空調システムで部屋間の空気の流れを消毒するには、長さ 20 m のエアダクトの場合は 1 秒未満、長さ 2 m のエアダクトの場合は 0.1 秒未満、または 0.2 メートルのエアダクトの場合は 0.01 秒未満で消毒を完了する必要があります。メートルの長さのエアダクト。したがって、安全（有毒または引火性化学物質を含まない）かつ迅速（流れる空気を消毒するのに十分な速さ）の消毒方法が必要です。

以前の研究によると、放射線ベースの不活化方法は有毒または可燃性化学物質と比較して安全であり、SARS-CoV-2および関連コロナウイルスの不活化にはより便利です。すべての放射線ベースの不活化法の中で、紫外線殺菌照射 (UVGI) は、SARS-CoV-214 を不活化するために最も広範囲にテストされ、広く使用されている方法です。 UV 発光ダイオード (LED) と UV ランプは、UV 光源として使用される最も一般的な候補です 15。ただし、どちらにもいくつかの欠点があります。 LED の電力効率は非常に低いです。したがって、通常、多くの熱を発生し、実際の寿命は非常に短くなります。さまざまな出版物によると、UV LED およびランプは、少なくとも数秒後にのみ 99% を超えるウイルス不活化を達成できます (さまざまな出版物によると、私たちの知る限り)。これは、LED やランプなどの通常のインコヒーレント光源からの光は放射時に非常に発散するため、光放射照度が非常に低くなるためです。レーザーなどのコヒーレント光源からの光は発散することなく伝播することができるため、通常のインコヒーレント光源よりも高い光放射照度が得られます。これは、波長約 260 ～ 270 nm の UV レーザーが安全かつ迅速なウイルス消毒に適していることを示唆しています。この原稿では、自家製 2 W 266 nm レーザーを使用して SARS-CoV-2 不活化実験を行い、その結果は 266 nm レーザーによる非常に効果的な SARS-CoV-2 不活化の超高速性能を確認します。

消毒性能は、シングルパス不活化効率の指数関数的減衰則に従います20:

ここで、η は不活化効率、k はウイルス種と波長に依存する UV 速度定数 (cm2/mJ)、D は UV 曝露量 (mJ/cm2) です。したがって、紫外線照射線量が高いほど、消毒率は高くなります。 UV 露光量 D は、UV 光放射照度 I (mW/cm2) と露光時間 t (s) の積です。

ここで、UV 光放射照度は単位面積あたりの光出力です。したがって、光放射照度は、光パワーを光ビーム面積で割ったものに比例します。これは、光パワーが同じままの場合に光ビーム領域がより小さな領域に集中すると、放射照度が劇的に増加する可能性があることを意味しており、レーザーに注目することになります。

図 1 は、レーザー、LED、ランプの伝播距離に対する一般的な放射照度を示しています。図 1 の黒い点線の水平線は、臨界実効線量 21 に対する臨界放射照度値 16.9 mW/cm2 であることに注意してください (文献にはそのような値が複数あり、例として 16.9 mJ/cm2 が取り上げられています)。 SARS-CoV-2 を完全に不活化するには 1 秒の曝露時間。

(1) 出力 2 W、ビームウェスト r = 1 mm および 5 mm のレーザー、(2) 出力 200 W、頂角 θhalf = 45° および 60°の LED、および(3) 出力 200 W、長さ L = 40 cm および 80 cm のランプ。黒の一点鎖線の水平線は、曝露時間が 1 秒 21 の場合の SARS-CoV-2 不活化の臨界線量 16.9 mJ/cm2 に対応します。

LED やランプとは異なり、レーザーは、半径方向にガウス波面、軸方向にガウスプロファイルで伝播するコヒーレント光を提供します。たとえば、高ビーム品質の 266 nm レーザーの場合、ビームウェスト半径 1 mm と 5 mm は、それぞれ約 10 m と 250 m のレイリー範囲に対応し、そのようなレーザービームの放射照度と伝播を図に示します。 1. レイリー範囲は、レーザーガウスビームがほぼ同じビーム半径を維持する距離の尺度です。したがって、ウエスト半径5 mmのレーザー光は、ビーム拡張なしで数百メートル伝播できます。これは、LED光源やランプなどの日常生活で一般的に使用される光源とは大きく異なります。

レーザー伝播とは対照的に、LED やランプからの光などのインコヒーレント光は伝播中に常に膨張するため、放射照度は伝播距離の 2 乗に反比例します。たとえば、LED 光源は通常、円錐形に光を放射します。これは一般に円錐の頂角によって特徴付けられ、一般的な値は θhalf = 45° および 60° です。通常、1 つの LED チップは 2 mW ～ 10 mW を放射できるため、200 W LED 光源は多数の単一 LED チップで構成されます。光が LED 光源から伝播する間の放射照度を考慮しているため、LED アレイは一定の円錐頂角を持つ均一な分布の点光源として単純化できます。 θhalf = 45°および60°の200 W LED光源の放射照度と伝播を図1に示します。非常に直観的には、ランプは全方向に光を放射し、ほぼ4πの立体角にわたって放射していることがわかります。ただし、伝播方向に沿ったランプ放射照度のより正確な図を取得する目的で、長さ L = 40 cm および 80 cm22、電力 200 W の長い円筒ランプ電球に Keitz モデルを適用します。計算結果も図1に示します。

図 1 の黒い四角破線を詳しく調べると、ウエストビーム半径 5 mm の 266 nm レーザービームを表しています。このレーザービームの放射照度は、200 を超える伝播範囲で 16.9 mW/cm2 の 100 倍以上高くなっています。メートル。したがって、この 200 m の伝播範囲では、0.01 秒未満の露光時間で 16.9 mJ/cm2 の臨界実効線量に達する可能性があります。これは、SARS-CoV-2 の超高速不活化が 266 nm レーザーで長いスパンにわたって達成できることを示唆しています。

レーザー不活化の有効性を検証するため、SARS-CoV-2/武漢/WIV04/2019 (SARS-CoV-2 WIV04) および SARS-CoV-2/630–1 (SARS-CoV-2 デルタ) が実験に含まれました。分子構造は似ているが宿主細胞が異なるシンドビスウイルス (SINV) を使用して、周囲の環境がレーザー照射に対するウイルスの感受性に影響を与える可能性があることを確認しました。遺伝物質として DNA を持つ仮性狂犬病ウイルス (PRV) は、UV によって損傷される DNA と RNA のメカニズムの違いを考慮して、RNA ウイルスとの比較に使用されました。つまり、DNA に対する UV 照射消毒のメカニズムの 1 つは TT 二量体形成であり、DNA に対する紫外線照射による消毒のメカニズムの 1 つは、DNA に対する TT 二量体の形成です。 RNA、それはUU二量体形成です。エンベロープを持たない RNA/DNA を持つヒトエンテロウイルス 71 (EV71) とブタパルボウイルス (PPV) を使用して、ウイルス感受性に影響を与える可能性のあるウイルスエンベロープと UV 光子の間の相互作用をテストしました。

実験で使用した細胞株には、中国科学院武漢ウイルス研究所の国立ウイルス資源センターから入手したVero E6、BHK、PK15、STおよびRD細胞が含まれており、これらは最小必須培地（MEM、Gibco™、カタログ番号: 42360032)、10% ウシ胎児血清 (FBS) (Gibco、10099-141) およびそれぞれ 100 U/mL のペニシリンおよびストレプトマイシン (Gibco、15140-122) を添加し、37 °C、5% CO2 インキュベーター内で培養しました。実験で使用したウイルスと細胞を表 1 に示します。

SARS-CoV-2 WIV04 および SARS-CoV-2 デルタは、Vero E6 細胞で増殖しました。 Vero E6 細胞を T-75 細胞培養フラスコに一晩播種し、細胞が 80% コンフルエントになったときに感染多重度 (MOI) = 0.1 でウイルスを培養液に接種しました。感染した細胞培養フラスコをウイルス吸着のために 37℃ のインキュベーターに 1 時間置き、MEM + 2% FBS の新鮮な培地に交換しました。 2日後、感染細胞の上清を15 mL遠心管に集めました。 4℃、3000r/minで10分間遠心分離した後、細胞断片を廃棄し、ウイルスを得た。得られたウイルスは分離され、後で使用するために -80 °C の冷蔵庫で凍結されました 23。

さらに、SINV は BHK 細胞で 0.01 MOI で増殖し、EV71 は RD 細胞で 0.01 MOI で増殖し、PRV は PK15 細胞で 0.1 MOI で増殖し、PPV は ST 細胞で 0.1 MOI で増殖し、24 時間後に回収されました。、それぞれ２４時間、４８時間、および７２時間。彼らが懸濁した培地は依然として MEM + 2% FBS でした。それらは SARS-CoV-2 と同じ方法で採取されました。 SARS-CoV-2 実験を含むすべての実験はバイオセーフティ 3 実験室 (P3) で実行され、SINV、PRV、EV71 および PPV 実験はバイオセーフティ 2 実験室 (P2) で実行されました。すべてのウイルスは、中国科学院武漢ウイルス研究所の国家ウイルスリソースセンターから入手しました。

Vero E6、BHK、RD、ST、および PK15 細胞を 6 ウェルプレートに一晩播種しました。細胞接種密度はウェル当たり10 4 であった。 -80℃の冷蔵庫に保存されたウイルス株を採取しました。ウイルスを解凍した後、MEM + 2% FBS を使用して 10 倍勾配希釈を実行し、10-1 から 10-9 まで合計 9 つの希釈を行い、各希釈で 6 ～ 8 回繰り返しました。接種の 3 日後、細胞変性効果 (CPE) がスコアリングされ、Reed-Muench 式を使用して 50% 組織培養感染量 (TCID50) が計算されました 24。ウイルス接種材料の力価は、〜6μg TCID50/0.1ml25で開始した。力価の下限は、１μｇＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ（完全に不活化）であった。

パルス幅 10 ps、繰り返し率 200 kHz、出力調整可能な社内製パルスレーザーを使用しました。レーザーヘッドの端面でのビームの直径は約 5.16 mm、ビームの広がりは約 18mrad です。テストされた波長は 266 nm で、これは約 260 nm の RNA 吸収最大値に近いです15。 HR4000CG-UV-NIR (Ocean optics) によって記録されたレーザーのスペクトルを図 2 に示します。

レーザーのスペクトル。

0.1 mL のウイルス接種材料の液滴を 6 ウェルプレートの規定のウェルに配置しました。次に、レーザーヘッドをウイルスを含むウェルの上約 10 cm に配置しました。レーザーのスポットサイズは 0.785 cm2 または 0.601 cm2 (ウェル内のウイルス接種材料液滴の表面積を完全にカバー) でした。指定された時間の曝露後（レーザーシャッター、GCI-7102 M Daheng Optics Ltd.を使用して制御）、各ウイルス接種材料をウイルス滴定に供しました。私たちの実験で実行された反復の数は 3 です。

UV 速度定数 k は η = 1−e−kD から当てはめられます。ここで、不活化効率 η は力価減少のパーセンテージ、D は UV 曝露量です。 k 値は、SARS-CoV-2 WIV04 の場合は最初の 2 ポイントを使用し、他のウイルスの場合は最初の 3 ポイントを使用して作成されます。これは、SARS-CoV-2 WIV04 では小から大までの 3 回目の投与の力価が下限値 (1 Lg TCID50/0.1 ml) に達するためですが、他のウイルスではこれが 4 回目の投与で現れます。 k が得られたら、示された不活化効率、たとえば 90%、99%、99.9%、および 99.99% に必要な用量も、η = 1-e-kD を使用して計算できます。表示された不活化効率に必要な時間は、D = I∙t を使用して計算されます。

MEM メディアと 6 ウェルプレートの吸収と反射は、補足資料 1 として含まれています。実験分析では、MEM メディアに吸収されるエネルギーの割合は 39.69% です。吸収されたレーザー線量 Dabsorbed は、Dabsorbed = 39.69% Dirradiated として計算できます。Dirradiated は照射されたレーザー線量です。 UV 速度定数 kaabsorbed は、kabsorbed = kirradiated / 39.69% として簡単に計算できます。簡単にするために、変換は行わず、次の分析では D および k として Dirradiated および kirradiated のみを使用します。

有効性を検証し、種依存の UV 速度定数を計算するために、図 3 に示すように、一連の暴露時間でのウイルスの 266 nm レーザー不活化をテストしました。不活化実験の生データと計算は補足として含まれています。資料 2. まず、SARS-CoV-2 WIV04 および SARS-CoV-2 デルタウイルスの不活化を図 3a、b に報告します。パルス266nmレーザーは、1秒で約99％の不活化（約2μg TCID50/0.1mlの減少に相当）を達成し、5秒後に完全な不活化（1μg TCID50/0.1mlまで低下）を達成することができた。これは、レーザーアプローチの有効性を確認するための最初のステップです。次に、図 3c に示すように、SINV を使用して非 SARS-CoV-2 ウイルスに対する有効性を確認しました。 SINVは、ゲノム11.7 kbの約70 nmの一本鎖エンベロープRNAウイルスであり、SARS-CoV-2（100～150 nmの一本鎖エンベロープRNAウイルス、27～32 kbのゲノム）に匹敵します。パルス 266 nm レーザーは、1 秒で約 99% の不活性化を達成し、10 秒後に完全な不活性化を達成することができました。最後に、検証実験におけるウイルスの種類は、エンベロープを持つ DNA (PRV)、エンベロープのない RNA (EV71)、エンベロープのない DNA (PPV) まで拡張されました。結果は、図3d〜fに示すように、1秒の照射後にこれら4つのウイルスすべてで約99％の不活化が達成され、10秒後には完全な不活化が達成されたことを示しました。これらの結果を総合すると、試験した 6 つのウイルスすべてが 266 nm のパルス UV レーザー照射に対して非常に感受性が高いことがわかります。

照射線量に対するウイルス接種力価。ウイルス接種材料サンプルに 266 nm レーザーを一連の露光時間で照射し、ウイルス滴定によって力価分析を実行しました。 (a) SARS-CoV-2 WIV04 ウイルス、(b) SARS-CoV-2 デルタウイルス、(c) SINV、(d) PRV、(e) EV71、および (f) PPV。

この方法の現実世界への適用可能性を示唆するために、表 2 に示すように、さまざまな低減レベルを達成するための UV 速度定数、線量、および曝露時間を計算しました。UV 速度定数は、消毒システム設計における中心的なパラメーターです。 UV 光に対する微生物の感受性は、不活化効率と UV 線量を相関させる UV 速度定数 k を使用して評価されます。各種類のウイルスは特定の k に対応します。速度定数の値が高いということは、特定の不活化効率に必要な用量がより低いことを意味し、またその逆も同様です。さまざまな低減レベルを達成するために必要な線量は、UV ランプと LED を使用してさまざまな出版物で得られた線量と同等でした 16、21、26、27、28。これは、SARS-CoV-2 およびその他のウイルスが 266 nm のパルスレーザーに対して感受性があることを示しています。高放射照度（通常、UV ランプや LED の放射照度より 2 ～ 3 桁高い）を備えたパルス 266 nm レーザーは、高速消毒の有望な戦略となる可能性があります。

k 値に対する Tukey の事後検定を用いた一元配置分散分析により、6 種類のウイルス間に統計的に有意な差 (P < 0.0001) があることがわかりました。特に、SARS-CoV-2 WIV04 の k 値（すべての比較で調整 P < 0.0001）および SARS-CoV-2 デルタ（すべての比較で調整 P < 0.00153）は、SINV、PRV、EV71 の k 値よりも大幅に高くなっています。とPPVそれぞれ。特に、SARS-CoV-2 WIV04 は、SARS-CoV-2 デルタよりも有意に高い k 値を示しました（調整 P < 0.0001）。 SARS-CoV-2 は 6 種類のウイルスの中でより優れた 266 nm レーザー不活化感度を示し、一方、SARS-CoV-2 WIV04 は最も優れた性能を示したことが実証されています。 SINV、PRV、EV71、および PPV グループ間の k 値に有意差はありませんでした (すべての比較で Adj. P > 0.06846)。これは、これらのグループ間で 266 nm のレーザー不活化感度が近いことを示しています。一元配置分散分析により、DNA ウイルスと RNA ウイルスの間に有意差はありませんでした (P = 0.13951)。また、一元配置分散分析によって、エンベロープウイルスと非エンベロープウイルスの間に有意差はありませんでした (P = 0.16562)。

まず、レーザー、LED、ランプ間の計算と比較に基づいて、266 nm レーザーが安全かつ迅速なウイルス消毒の良い候補となり得ることを提案しました。次に、実験を通じて、パルス 266 nm レーザーによる SARS-CoV-2 ウイルスの不活化の超高速性能と高い有効性を示しました。 266 nm パルスレーザーは、SARS-CoV-2 WIV04 および SARS-CoV-2 デルタウイルスに対して 1 秒の曝露時間で約 99% の不活化を達成することができました。 SINV (エンベロープのある RNA)、PRV (エンベロープのある DNA)、EV71 (エンベロープのない RNA)、および PPV (エンベロープのない DNA) も 266 nm のパルス UV レーザー照射に対して非常に感受性が高く、UV レーザー消毒の普遍的な効果を示しています。 SARS-CoV-2 やその他のウイルスの超高速不活化は、ランプや LED に比べてレーザーの放射照度が高いことに起因します。最後に、さまざまな低減レベルを達成するための UV 速度定数、線量、および曝露時間が計算され、将来の消毒システム設計やその他の用途で中心的なパラメーターとして使用できます。この研究は、266 nm レーザーの不活性化が 1 回のパスで流れる空気を消毒するのに十分な速さであるという有望な見通しを示しています。エアロゾル消毒やチャンバーテストなどのさらなる検証実験を実施する必要があります。パルスの持続時間と繰り返し率は不活化効率に影響を与え、不活化メカニズムに違いをもたらす可能性があり、今後調査する価値があります。

実用的な超高速消毒方法としてレーザーをさらに開発し、実際の HVAC システムに適用するには、レーザービームの狭い領域 (結果として消毒領域または体積が小さくなる) が依然として主要な制限の 1 つです (もう 1 つの主な問題はコストです)。。解決策はレーザービームの拡大と整形であるはずです。その代償として、放射照度が大幅に減少します（スポット半径の二乗に反比例します）。放射照度の低下を補うには、レーザーの出力を増加する必要があります (コストの問題がさらに悪化します)。したがって、設計された消毒量と線量を満たすレーザー活性ゾーンを合理的なコストで生成することが、実用的な消毒方法となるレーザーの開発を成功させる鍵となります。必要なことは、大きなアクティブ領域を達成するためのビーム整形の最適設計、光学コンポーネントの選択による出力損失の最小化、およびワットあたりのレーザーコストの削減です。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、中国国家自然科学財団 [助成金番号 81927805] の支援を受けました。広東省科学技術計画プロジェクト [補助金番号 2018B090944001]; および広東省の基礎および応用基礎研究の主要プロジェクト[助成金番号 2019B030302003]。国立ウイルスリソースセンターのチームメンバー全員に感謝いたします。

中国湖北省武漢の華中科学技術大学機械科学工学部デジタル製造機器および技術の国家重点実験室

Kexiong Sun、Han Wu、Xinyu Shao、Xiuquan Ma

GZ Photonics Technology Co., Ltd.、中国広東省東莞市

ガン・ニウ

中国湖北省武漢、中国科学院武漢ウイルス研究所、国家ウイルス学重点研究所および国家ウイルス資源センター

ヤンファン・チャン、ジュアン・ヤン、ダンナ・チャン

中国湖北省武漢のオプティクスバレー研究所

馬秀泉

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KS と GN がレーザーを開発しました。 YZJYとDZが実験を行いました。 HW はプロジェクトを組織し、結果を分析しました。 XSはチームを作りました。 XM はオリジナルのアイデアを開発しました。

ハン・ウーへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Sun, K.、Niu, G.、Zhang, Y. 他 266 nm レーザーによる SARS-CoV-2 の超高速不活化。 Sci Rep 12、18640 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23423-2

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受信日: 2022 年 5 月 28 日

受理日: 2022 年 10 月 31 日

公開日: 2022 年 11 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23423-2

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