超高速 | 河北レーザーマーキング株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11935 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ウイルス不活化に使用される紫外線（UV）照射ベースの方法は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）ウイルスを標的とする重要な手段となっている。最先端の UV 不活化技術の主な問題は、効率が限られており、高出力、大量の線量、長い照射時間を必要とする UV ランプに基づいていることです。これらの欠点により、空気濾過システムやその他の用途での UV ランプの使用が制限されます。これらの制限に対処するために、ここでは、UV反射材料であるポリテトラフルオロエチレンで構成される集積キャビティ（LIC）に結合されたパルスナノ秒266nm UVレーザーを含むデバイスの製造について報告します。以前の UV ランプ不活化キャビティは、鏡面反射を備えた研磨された壁に基づいていましたが、拡散反射 UV IC はウイルスの不活化について十分に検討されていませんでした。私たちの結果は、LIC デバイスが UV ランプと比較して 2 桁以上高い効率で、約 1 ミリ秒の有効照射時間で SARS-CoV-2 を含むいくつかの呼吸器ウイルスを不活化できることを示しています。直接露光と比較して実証された 3 桁のキャビティ強化は、効率的なリアルタイム UV 空気および水浄化システムの開発にとって重要です。私たちの知る限り、これは高効率で広範なウイルス不活化のための LIC アプリケーションの最初の実証です。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2 (SARS-CoV-2) の世界的なパンデミックの発生に対抗するため、ワクチン接種や患者の治療のために、調整可能な物理的および化学的特性を備えたさまざまなナノ材料が開発されました 1,2。また、光電気化学的酸化支援空気清浄機は、屋内の SARS-CoV-2 曝露を制御する潜在的なツールとして開発されました3。しかし、パンデミックウイルスは空気や表面を介して伝播するため、特に病院、空港、店舗などの公共の場所で、表面や空気中のウイルス粒子を不活化する迅速かつ効率的な方法を開発する緊急の必要性があります。パンデミックと将来のパンデミックの可能性。

現在、さまざまな光媒介消毒プロトコルが、表面、空気、水のサンプル、および個人用保護具に対して検証されています4。ウイルス病原体を不活化する効果的な非接触方法としての UV 照射は、主に低圧水銀ランプや発光ダイオードの形で長い間使用されてきました 5、6、7、8。 UVC 光 (100 ～ 280 nm の範囲) は、UVA (315 ～ 400 nm) や UVB (280 ～ 315 nm) を含むさまざまな UV 範囲の中で、抗菌および抗ウイルスの不活化効率が最も高くなります9。核酸の最大吸収は約 265 nm であり、UVC 光は、隣接する 2 つのピリミジンの共有結合二量体への光化学的融合、RNA とタンパク質の架橋、および部位特異的な分子損傷を誘発することによって損傷を引き起こします10。紫外線は、ヒトエンテロウイルス、ジカウイルス、E型肝炎、デング熱、西ナイルウイルスなどの治療のために研究されており11、12、13、14、15、16、17、18、19、そして最近ではSARS-CoV-220の治療にも使用されています。、21、22、23、24、25、26、27、28。紫外線の殺ウイルス効果は、対象となる病原体、環境、除染される物質など、多くの要因によって影響を受けます29。さらに、殺菌性 UV は、SARS-CoV-232 を含むウイルスを消毒するための熱処理と組み合わせられています 30,31。 UV ランプの問題点としては、効率が限られていること、高出力と長い照射時間 (大量の線量) が必要であること、これには時間がかかり、空気が UV ランプを通過するのは非常に短い時間であるため、多くの空調システムでの使用には適していないことが挙げられます。時間の。加熱の欠点には、効率が低いことと、環境への熱損失が大きいことが挙げられ、追加の冷却努力が必要となり、不活化コストが増加します。

さらに、425 nmの可視（Vis）および約800 nmの近赤外線（NIR）の超短レーザーパルスがウイルスを不活化することが報告されています33、34、35。ウイルスキャプシドタンパク質の凝集を引き起こす衝撃的刺激ラマン散乱が主な不活化機構であることが示唆された 33。ただし、パルス可視近赤外照射の不活化効率は殺菌 UVC ランプよりも低くなります。ナノ秒エキシマ 308 nm レーザーなどのパルス UVB レーザーもウイルス不活化に使用されましたが、Vis-NIR36 と同様に効率が低かったです。 193 nm エキシマや 266 nm の第 4 高調波 Nd:YAG などのパルス UVC レーザーを使用すると、高い効率が得られました37,38。ナノ秒の 266 nm UV パルスレーザー照射により、254 nm UVC ランプと比較して量子収量が 1 桁以上増加し、ベネズエラ馬脳脊髄炎 (VEE) ウイルスの不活化における RNA とタンパク質の架橋の非線形 2 量子機構が明らかになりました。これは、パルス UV レーザーと UV ランプ照射の両方に存在する従来のピリミジン二量体形成メカニズムの線形 1 光子の性質とは対照的です。パルス UV レーザーアブレーションは、熱分解や光化学分解などのいくつかのメカニズムの組み合わせに基づいており、従来の UV ランプを超えてウイルス不活化効率を高めることができます。 UV パルスは、単位時間あたりにより多くのエネルギーを含み、連続 UV 光よりも溶液にさらに浸透できます 37。一方、UV パルスは Vis または NIR パルスよりも強い吸収に対応し、より効果的な不活化をもたらします。

光吸収は、UV パルスレーザーを集積キャビティ (IC) に結合することによって強化できます。一般的な IC は球形の形状を持ち、壁は高反射拡散散乱材料で作られています 39,40。壁から散乱するランバート光は、IC 内に均一な場と大きな有効光路長を生成し、センシングや分光用途に使用されています 41、42、43、44。これまで病原体不活化にさまざまな UV ボックスやキャビティが使用されてきましたが 45、IC の殺ウイルス特性はあまり研究されていません。 IC の拡散散乱の性質は、微粒子によるウイルスの遮蔽を低減する可能性がある照射角度の範囲が広いため、従来のキャビティの鏡面散乱に比べて利点があります。したがって、IC に結合されたパルス UV レーザーは、短縮された時間でより効率的にウイルスを破壊できるという仮説を立てました。この仮説を検証するために、我々はここで、レーザー統合キャビティデバイス（LICD）と呼ばれる、統合キャビティに結合されたパルスナノ秒266nm UVレーザーに基づく新しいウイルス不活化デバイスを開発した。我々は、SARS-CoV-246 や 229E コロナウイルス (HCoV-229E)47、呼吸器合胞体ウイルス (RSV)48 などのヒトコロナウイルスの不活化を調べました。我々の結果は、LICD が有効総照射時間約 1 ms でウイルスの 99.9% を不活化できることを示しており、これは効率が 3 桁以上向上していることを示しています。私たちの知る限り、これは、SARS-CoV-2を含むヒトコロナウイルスの不活化にパルスUVCレーザー統合キャビティを使用する最初のデモンストレーションです。

レーザー照射の 2 つの異なる方法が調査されました。(1) UV レーザー光線へのウイルスの直接照射 (図 1a)。 (2) LICD 筐体内のランダムな場所にウイルスを置いた場合、ウイルスが UV レーザー照射に間接的に曝露される (図 1b)。我々は、266 nm ナノ秒パルス UVC レーザーを、UV 反射率の高いポリテトラフルオロエチレン (PTFE) コーティングで作られた円筒形の IC エンクロージャに結合することによって LICD を設計しました49,50。 LICDの詳細な回路図と空間寸法を図S1に示します。直接曝露の場合、図 1a に示すようにプラスチック製バイアルを水平に置き、ウイルス液滴をバイアルの底に保持しました。 LICD 曝露の場合、図 1c に示すように、1 つのバイアルをエンクロージャの底部にランダムに配置し、2 つ目のバイアルをエンクロージャの側壁にランダムに配置しました。

超高速 UVC レーザー一体型キャビティを使用したウイルス不活化。 (a) バイアル内のウイルス溶液の液滴に対するパルス UVC レーザーの直接照射の概略図。 (b) キャビティ内の開口部 a2 の位置に置かれたウイルスの液滴に対する UVC レーザー照射の LICD 露光の概略図。 (c) バイアル内のウイルス液滴が存在する空洞の写真。 (d) UVC レーザー光で満たされたキャビティ、および 2 パス目からの蛍光の反射と、a2 開口部に配置された白いカード上の 2 つの明るいスポットとしてのマルチパス散乱の写真。 (e) 拡散反射 LICD キャビティ壁として使用される PTFE シートの AFM 高さ画像。（ f 、 g ）未処理（U）およびUVCレーザー処理（T）HCoV-229EビリオンのAFM高さ画像。スケールバーは0.3μmです。 (h) 未処理および処理済みの HCoV-229E ビリオンの平均高さと幅。

入射レーザー光線が筐体の内壁で反射された後、拡散散乱光は複数回の反射を受け、体積全体を均一に満たします。拡散散乱効率は、キャビティの出口開口部に配置された白いカード上の2つの蛍光スポットの明るさを観察することによって推定できます（図1d）。 2 回目のパスからのスポットは、入射レーザービームによってキャビティ壁から直接反射されます。マルチパス散乱からのスポットは同様の明るさを持ち、キャビティ壁の拡散反射率が高いことを示しています。 PTFE コーティングは、多孔質構造により、93% 以上の全方向拡散反射率を備えています。

原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して、IC 壁の形態学的特性を調査しました。図 1e は、IC の反射材として使用される PTFE シートの AFM 高さ画像を示しています。観察された不規則性は、図 S2a の白い破線で強調表示されているナノ粒子と細孔の存在によるものです。図 S2b の AFM 分析では、平均粒子サイズが 0.44 μm、平均細孔サイズが 1.86 μm であることが示されました。典型的な粒子と細孔のAFMプロファイルをそれぞれ図S2cとS2dに示します。パルスUVCレーザー曝露によって引き起こされる形態学的変化を観察するために、未処理（未照射）および処理済み（直接パルスUVCレーザーで照射された）HCoV-229Eビリオンに対してAFM測定を実行しました（図1f、g）。処理されたウイルスは 30 分間照射されました。完全な不活化（99.99%以上、下記参照）を確実にするために、30分間の処理を選択しました。統計分析のために、処理サンプルと未処理サンプルの両方から 10 個のビリオンが選択されました。未処理ビリオンの平均高さは約31 nmでしたが、処理済みビリオンの平均高さは約19 nmでした（図1h）。横幅プロファイルは、未処理ビリオンの平均幅〜159 nm、および処理ビリオンの平均幅〜82 nmを示しました（図1h）。

未処理および処理ビリオンの典型的な例の AFM 高さプロファイルを図 S3a および S3b に示します。これらの結果は、超短 UVC レーザーパルスに曝露した後のウイルス粒子の収縮を示しており、ウイルスの不活化に対するアブレーションメカニズムの寄与が確認されています。

コロナウイルスの不活化を調査するために、266 nm ナノ秒 UVC レーザーを直接照射して HCoV-229E ウイルスを不活化しました。ＰＢＳ中の６μｌのウイルス液滴を上記のようにバイアルに入れた。 1、5、10、および 30 秒のレーザー照射時間は、3.5、17.6、35.3、および 105.9 mJ/cm2 の線量に対応します。 UVC レーザーの直接曝露により、HCoV-229E 複製は 4 秒曝露後に完全に不活性化されました (99.9% 減少)。これは、229E スパイク (S) の qPCR を使用して測定された 15.6 ± 0.3 mJ/cm2 線量に相当します (図 S4a)。 Calu-3細胞における感染72時間後のヌクレオカプシド（N）（図2a）転写物。 IC 筐体内のウイルス複製に対する UVC レーザーへの間接曝露の影響を調査するために、IC 内の 2 つのランダムな位置でバイアル内に配置された PBS 中の HCoV-229E ウイルス液滴の LICD 曝露を実行しました (図 S1 を参照)。照射時間は 10、30、120、1800 秒で、それぞれ 0.05、0.15、0.6、9 mJ/cm2 の線量に相当します。 0.63 ± 0.02 mJ/cm2 の UV 線量の後、感染 72 時間後に 229E S (図 S4b) および N (図 2b) タンパク質の qPCR で測定したところ、HCoV-229E ウイルス複製は不活化されました (99.9% 減少)。 Calu-3 細胞 (図 S5)。

HCoV-229E ウイルスを、指示された時間、直接パルス UVC レーザー (a) および空洞 (b) に曝露しました。 Calu-3 細胞を播種の 24 時間後に、示されたグループの 229E (3 MOI) で処理しました。感染後 72 時間で RNA を抽出し、qPCR を実行しました。陰性対照(NC)と比較した平均倍率変化±SEMを示す(N = 3)。一元配置分散分析およびダネット事後検定を使用して、0 秒と比較した有意性を決定しました。直接曝露（c）および空洞（d）によるUV照射時間の関数としてのHCoV-229E生存率。 *p < 0.05、**p < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

図2cは、直接不活化動態の対数線形生存プロットを示しています。ここで、N0およびNは、qPCR分析から決定された感染性ウイルスユニットの初期濃度および最終濃度です。「方法」セクションで説明したように、グラフの線形部分のみが一般的なアプローチ 51 に従ってフィッティングされました。線形回帰フィットにより、不活化速度定数 k = 0.443 ± 0.006 mJ/cm2 が得られました。図 2d は、LICD 生存プロットと、不活化速度定数 k = 10.9 ± 0.4 mJ/cm2 での線形回帰フィッティングを示しています。これらの結果は、パルス UVC レーザーへの直接曝露と LICD 曝露の両方が、宿主細胞内で複製するウイルスの能力を根絶することを示しています。ただし、LICD は、同様の不活化を達成するのに必要な用量が少ないため、一桁効果が高くなります。

次に、266 nm ナノ秒 UVC レーザーの直接露光を実行して、SARS-CoV-2 を不活化しました。上述のように、直接およびＬＩＣＤ曝露のために、バイアルに入れたＰＢＳ中のウイルスの２３μｌ液滴を使用した。 30、60、120、および 300 秒の照射時間は、それぞれ 105.9、211.8、423.6、および 1059 mJ/cm2 の線量に対応します。 UVCレーザーを直接照射すると、SARS-CoV-2の複製は3分および715 mJ/cm2の線量照射後に不活化（99.9%）され、蛍光顕微鏡（図3a〜d）およびSARS-CoV-2のqPCRを使用して測定されました。 Calu-3細胞における感染48時間後のSタンパク質（図S6a）およびNタンパク質（図3i）。次に、それぞれ 0.15、0.3、0.6、1.5 mJ/cm2 の曝露量に相当する 30、60、120、および 300 秒の照射時間で SARS-CoV-2 の LICD 曝露を実行しました。 0.60±0.02 mJ/cm2のUV線量の後、蛍光顕微鏡（図3e-h）およびSARS-CoV-2 S（図S6b）およびNのqPCRを使用して測定した場合、ウイルス複製は不活化されました（99.9％減少）。図3j) Calu-3細胞における感染48時間後の転写物。 SARS-CoV-2 感染は通常、炎症性タンパク質 TNF-α46 の病理学的増加を引き起こします。しかし、直接（図3k）およびLICD（図3l）UVCレーザー照射の両方に曝露した後、SARS-CoV-2感染により、Calu-3細胞におけるTNF-α発現が大幅に減少します。図 3m の直接曝露の生存曲線の線形回帰分析により、不活化速度定数 k = 0.00965 ± 0.00004 mJ/cm2 が得られました。図3nのLICDの線形回帰フィットにより、k = 11.2 ± 0.1 mJ/cm2の不活化速度定数が得られました。これは、LICD が直接曝露よりも 3 桁効率的であることを示しました。

SARS-CoV-2 ウイルスは、指定された時間の直接または空洞 UVC レーザー光に曝露されました。 Calu-3 細胞を、示されたグループの CoV-2 (0.1 MOI) を播種して 24 時間後に感染させました。（a〜h）EVOS顕微鏡（Thermo Fisher）を使用して、感染の48時間後に画像を撮影しました。 200X。スケールバー = 200 μm。（i – j）Calu-3細胞におけるSARS-CoV-2 Nタンパク質の発現。感染後 72 時間で RNA を抽出し、qPCR を実行しました。陰性対照(NC)と比較した平均倍率変化±SEMを示す(N = 3)。一元配置分散分析およびダネット事後検定を使用して、0 秒と比較した有意性を決定しました。（k-l）SARS-CoV-2感染後のCalu-3細胞における炎症マーカーの発現。ネガティブコントロールとして、CoV-2 を手持ちの杖の下で UVC 光に 2 分間曝露しました。感染後 48 時間で RNA を抽出し、qPCR を実行しました。陰性対照(NC)と比較した平均倍率変化±SEMを示す(N = 3)。一元配置分散分析およびダネット事後検定を使用して、0 秒と比較した有意性を決定しました。直接曝露 (m) および空洞 (n) による照射時間の関数としての SARS-CoV-2 生存率。 *p < 0.05、**p < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

次に、前の実験で得た Calu-3 細胞培養上清を使用して、新しいバッチの Calu-3 細胞を SARS-CoV-2 に再感染させました。 SARS-CoV-2 ウイルスを含む細胞培養上清に直接レーザーまたは LICD を照射してウイルスを不活化しました。レーザー照射時間は 60 秒と 120 秒で、直接露光の場合は 211.8 および 423.6 mJ/cm2、LICD の場合は 0.3 および 0.6 mJ/cm2 の線量でした。 UVCレーザーに直接曝露すると、SARS-CoV-2複製は211.8mJ/cm2の線量で完全に不活性化され、蛍光顕微鏡（図4a〜c）およびSARS-CoV-2N転写物のqPCR（図4e）を使用して測定されました。 Calu-3細胞の感染48時間後。 0.6 mJ / cm2のUV線量の後、Calu-3での感染48時間後に蛍光顕微鏡（図4d）およびSARS-CoV-2N転写物のqPCR（図4f）を使用して測定した場合、LICDではウイルス複製が不活化されました。細胞。これらの結果は、ダイレクトパルスUVCレーザーまたはLICDへの曝露後、SARS-CoV-2を含むコロナウイルスサンプルが培養細胞に増殖性感染を引き起こすことができなくなることを示しています。

直接またはキャビティ UVC レーザー光に曝露された SARS-CoV-2 感染 Calu-3 細胞からの培養上清による Calu-3 細胞の再感染 (図 3)。（a〜d）EVOS顕微鏡（Thermo Fisher）を使用して、感染の48時間後に画像を撮影しました。 200X。スケールバー = 200 μm。（e – f）Calu-3細胞におけるSARS-CoV-2 Nタンパク質の発現。感染後 48 時間で RNA を抽出し、qPCR を実行しました。陰性対照(NC)と比較した平均倍率変化±SEMを示す(N = 3)。一元配置分散分析およびダネット事後検定を使用して、0 秒と比較した有意性を決定しました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

別の呼吸器ウイルスに対する LICD をテストするために、次に赤色蛍光タンパク質を発現する RSV ウイルス (RSV-RFP) に 266 nm ナノ秒のパルス UV レーザーを照射し、照射時間は 1、5、15 秒、対応する線量は 3.5、17.6、52.9 秒でした。 mJ/cm2 (図S7a〜h)。蛍光顕微鏡で観察すると、17.6 mJ/cm2 の線量により、感染後 72 時間で Hep2 細胞のウイルスが完全に不活化されました。次に、RSV-RFP ウイルスを LICD に曝露したところ、0.3 mJ/cm2 という低線量で曝露された場合、感染 72 時間で Hep-2 細胞内の RSV-RFP が不活化されましたが、0.05 mJ/cm2 の線量でも不活化されました。ウイルスの大部分（図S7i〜p）。

対照測定として、RSV-RFP ウイルスを 337 nm パルスナノ秒 UVB レーザーに直接曝露しました (図 S8)。 UVB レーザー照射は、Hep-2 細胞における RSV-RFP ウイルスの複製に対して阻害効果を及ぼさなかった。これらの結果は、ウイルス不活化に UVC パルスレーザー放射を使用していることを裏付けています。ウイルス不活化のための 2 つの異なる UVC ランプ光源、Stratalinker ユニット (図 S9) とハンドヘルドワンド (図 S10) を使用して、追加の制御測定を実行しました。蛍光顕微鏡で観察したところ、両方の UVC ランプは、照射時間 5 秒、線量 68.5 mJ/cm2 で、感染後 72 時間で Hep2 細胞における RSV-RFP ウイルス複製を不活化することができました。ただし、LICD (線量 0.6 mJ/cm2、表 1) を使用すると、2 桁高い不活化効率が得られました。

表 1 は、HCoV-229E および SARS-CoV-2 の不活化動態の線形回帰分析の結果を示しています。不活化速度定数 k は、「方法」セクションで説明した生存曲線から得られました。表 1 には、90% (D90)、99% (D99)、および 99.9% (D99.9) を不活化するのに必要な UVC 線量も示しています。 D99.9 は、直接曝露を使用した場合、SARS-CoV-2 に対して 715 mJ/cm2 を必要とする「完全な不活化」を表しますが、LICD を使用した場合はわずか 0.6 mJ/cm2 です。この差は、「方法」セクションの EF 式によって与えられるキャビティ強化係数 (EF) 1160 (表 1) として定量化されます。

HCoV-229E を完全に不活化（99.9%）するには、直接曝露では 15.6 mJ/cm2 が必要でしたが、LICD を使用すると 0.63 mJ/cm2 のみで済み（表 1）、空洞により EF は 25 となりました。 LICD の不活化速度定数 k = 10.9 mJ/cm2 は、LICD に対する SARS-CoV-2 の不活化速度定数と同様でした。ただし、HCoV-229E の直接パルス UVC 曝露では、SARS-CoV-2 の k = 0.01 mJ/cm2 と比較して、より大きな速度定数 k = 0.44 mJ/cm2 が得られました。この違いは、より小さい液滴サイズ (6 μl) と構造的および形態学的違いに起因すると考えられます。

LICD 曝露で得られた不活化速度定数 k = 11.2 mJ/cm2 は、254 nm の UVC ランプを使用してこれまでに観察されたほとんどの ssRNA ウイルスの速度定数よりも 1 桁以上大きく、SARS-CoV で予測された速度定数の約 5 倍です。 -251。一方、直接曝露で観察された k = 0.01 mJ/cm2 は、254 nm ランプを使用した他の ssRNA ウイルスの典型的な文献値よりも一桁低い値です。この違いは、SARS-CoV-2 溶液の比較的大きな液滴サイズ (23 μl) や撹拌の不在などの異なる実験条件によって説明される可能性があります。これらの影響により、サンプル内の光が減衰し、k 値が低下する可能性があります。ただし、これらの効果は、IC 効果による不活化効率の増加を示す EF 値には影響しません。

アプリケーションの観点から見た UVC ランプとパルス UVC レーザー露光の主な違いは、有効照射時間にあり、パルスレーザーの方がはるかに短いです。単位時間当たりのレーザー照射の合計持続時間は、ナノ秒のパルス持続時間にパルス繰り返し率を乗じることによって得られます。この結果、LICD を使用した場合、HCoV-229E コロナウイルスと SARS-CoV-2 コロナウイルスの両方を不活化する有効合計照射時間は約 1 ミリ秒ですが、RSV を不活化するのにかかる時間はわずか約 0.1 ミリ秒となります。直接露光でも同様の不活化時間が必要ですが、LICD (約 200 cm2) と比較した直接露光 (約 0.2 cm2) の照射面積の違いにより、線量がより多くなります。ゲノム構成と非構造タンパク質の組成の違いにより、これら 3 つのウイルスにより、パルス UVC レーザーと LICD の広範囲にわたる不活化能力を実証することができます。

これらの研究では、広範な抗ウイルス LIC デバイスの開発に向けて、パルス 266 nm ナノ秒 UVC レーザーを使用してウイルスの高速不活化を実行しました。この新しいシステムをテストするために、HCoV-229E、RSV-RFP、SARS-CoV-2 を含む 3 種類のウイルスを使用しました。高紫外拡散散乱材料 PTFE を使用して製造された LICD と UVC レーザー光線の直接照射との比較により、LICD への照射後の効率的なウイルス不活化が実証されました。不活性化に必要な時間は、追加の光学素子を使用し、より高度な反射材料でデバイスの拡散反射特性を改善することによってレーザー出力を増加させることによってさらに短縮される可能性があります。また、ウイルスの不活化を超えて、LICD の適用は細菌 52、53、54 やカビ 55 などの他の病原体にも拡張される可能性があります。 UV レーザーの開発における技術進歩により、近い将来、コストが削減され、LICD 技術が広く利用可能になると予想されています。 LICD を空気および水の浄化システムに適用すると、不活化効率の向上による恩恵が得られます。 LICD ベースのエアコンは、飛行機、店舗、オフィスなどの密閉空間で使用できます。 LICD ベースの浄水システムは、家庭用および産業用環境で使用できます。 PTFE コーティングされた水道管は、その防汚特性と併せて廃水処理に役立つと思われます 56。

LICD は、UVC 露出部分がキャビティによって囲まれて保護されているため、公共の場所で使用できます。一般に、皮膚が UVC 放射線に曝露されると、UV の直接吸収または活性酸素種による酸化損傷が引き起こされる可能性があります 57。ただし、低線量の遠 UVC 光 (207 ～ 222 nm) は、暴露された人間の組織には無害である可能性があることが報告されています7。さらに、アルミニウムナノ粒子は、病原体を不活性化しながら、健康な組織の光損傷のリスクを大幅に軽減するための、紫外線放射に基づく量子医学的アプローチにおける遮蔽剤として提案された。

細胞株 (Calu3 および Hep2) は、American Type Culture Collection (ATCC、米国バージニア州) から購入し、25 回以下で継代しました。細胞は、5% CO2 (二酸化炭素) 雰囲気下、37 °C の加湿インキュベーター内で培養されました。細胞は、適切な完全細胞培養培地 [HEP2 = 10% ウシ胎児血清 (FBS) (Atlanta Biologicals) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (GE Healthcare) を含む DMEM (GE Healthcare)] [Calu3] 内の組織培養処理プレートで培養されました。 = 20% FBS、1% 非必須アミノ酸 (GE Healthcare)、1% 100 mM ピルビン酸ナトリウム (Gibco)、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む MEM (GE Healthcare)]。

これらの実験では 3 つの異なるウイルスが使用されました。呼吸器合胞体ウイルス (RSV-RFP)、ヒトコロナウイルス 229E (HCoV-229E)、および SARS-CoV-2 を発現する赤色蛍光タンパク質 (RFP)。 HCoV-229E は、BEI Resources、NIAID、NIH: ヒトコロナウイルス、229E、NR-52726 を通じて入手されました。 SARS-CoV-2 は、米国テキサス州ガルベストンにあるテキサス大学医学部の Pei-Yong Shi 博士から提供されました59。すべての実験で使用した RSV 株 (RSV-RFP) は、赤色蛍光マーカー mKate2 と臨床株 Line 19 由来の F タンパク質を発現する組換え A2 株 (rA2-KL19F) でした。すべての実験手順を含む RSV-RFP および HCoV-229E の取り扱いと保管は、バイオセーフティレベル 2 (BSL-2) の実験室で行われました。 SARS-CoV-2 を使用した取り扱い、保管、実験は BSL-3 実験室で行われました。すべての実験では、コンフルエンス 80% の Hep2 (RSV-RFP) または Calu3 (SARS-CoV-2 および HCoV-229E) 細胞の単層を、さまざまな濃度の示されたウイルス MOI (図の凡例に示すとおり) で感染させました。次に細胞を、Opti-MEM (Life Technologies) 中でウイルス接種材料とともに 37 °C で 2 時間インキュベートしました。この後、感染培地を新鮮な増殖培地に置き換えました。蛍光顕微鏡 (Keyence BZ-X800 または EVOS) を使用して細胞を画像化し、次に細胞ペレットを RNA 分析のために収集しました。

メーカーのプロトコールに従って、Trizol (Thermo Fisher Scientific) を使用して細胞ペレットから全細胞 RNA を抽出しました。 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) を使用して RNA を定量しました。次に、Maxima cDNA 逆転写キット (Thermo Fisher Scientific) を製造業者のプロトコールに従って使用して、1 マイクログラムの RNA を逆転写しました。 cDNA に対して実行された qPCR を使用して、対照としての β-アクチンに対する特定の遺伝子の相対発現レベルを定量しました。メーカーのプロトコールに従い、Integrated DNA Technologies (IDT) から入手したプライマーを使用し、Bio Rad CFX-384 サーモサイクラーで BlazeTaq SYBR Green qPCR Mix 2.0 (Genecoepia) を使用してリアルタイム分析を実行しました。 ΔΔCt 計算を使用してデータを分析し、すべての遺伝子の発現をハウスキーピング遺伝子としての β アクチン発現に対して正規化しました。次いで、対照と比較した平均倍率変化±SEMを計算した。データ分析は、CFX Maestro ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して実行されました。

> 93% の UVC 反射率を示した厚さ 0.75 mm の高反射率多孔質 PTFE シート (Thorlabs) を使用して、円筒形の統合キャビティ (IC) を構築しました。概略図と空間寸法を図 S1 に示します。

IC 内の光路の増加は、Fry らのアプローチを使用して推定できます 39,42。積分空洞内の反射間の平均距離 \(\overline{d }\) = 4.1 cm は \(\overline{d }\) = 4\(\frac{V}{S}\) で与えられます。ここで、Vはキャビティの体積、S は表面積です。 IC 内部の平均光路長 L = 63 cm は、L = 4\(\frac{V}{S(1-\rho )}\) によって計算されました。ここで、\(\rho\) = 0.935 は IC の反射率です。 266 nm での PTFE の反射率から推定されます。各ウイルスの空洞増強係数 (EF) は、EF = \(\frac{{k}_{cavity}}{{k}_{direct}}\) によって計算されました。ここで、\({k}_{direct} \) および \({k}_{cavity}\) は、以下に説明する直接および LICD 暴露の不活化速度定数です。

以下の UV 光源を使用しました: (i) パルス UVC 光源は、平均出力 1 mW、パルス時間持続時間約 1 ns、繰り返し率 10 kHz の 266 nm Nd:YAG ナノ秒パルスレーザー (JDS Uniphase NanoLaser™) でした。 (ii) パルス UVB 光源は、平均出力 5.2 mW、時間パルス持続時間 < 4 ns、繰り返し率 10 Hz の 337 nm 窒素レーザー (VSL-337ND) でした。 (iii) Cw UVC ランプ (Stratalinker® UV Crosslinker 1800) には、それぞれ 8 W、波長 254 nm の 5 つの電球がありました。（ｉｖ）ＣｗＵＶＣランプ（ハンドヘルドワンド、Ｃｌｅａｒ－Ｒａｚｅ（商標））は、２５４ｎｍの波長を有する１８Ｗの電球を有していた。

不活化実験の結果は、qPCR 相対遺伝子発現データを使用して分析されました (図 2 および 3)。表 1 の線形回帰パラメーターは、ln(N/N0) = −k D で与えられる一次反応速度論を使用して計算されました。ここで、N/N0 は生存率、N は各 UV 線量 (D) での相対遺伝子発現です。 N0 はゼロ用量での相対遺伝子発現です。実験は、HCoV-229E については 3 回、SARS-CoV-2 については 4 回繰り返し行われました。不活化速度定数 k (mJ/cm2) は、各ウイルス株および直接曝露と LICD 曝露の両方について計算されました。ウイルスの 90% (D90)、99% (D99)、および 99.9% (D99.9) を不活化する負荷軽減量は、D90 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0.9]) で求められます。 }{k}\)、D99 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0.99]}{k}\)、D99.9 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1 -0.999]}{k}\)。

ウイルス滴を、10%リン酸緩衝ホルマリンを使用して20分間不活化し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して洗浄した。原子間力顕微鏡 (AFM) 測定 (OmegaScopeR、Horiba Scientific) は、ドロップキャスティングによって SiO2/Si 基板上に堆積されたウイルス上で、平均チップ-サンプル間距離 20 nm のタッピングモードで Si チップ (Micromash) を使用して実行されました。 AFMには2μm*2μmの走査領域が選択され、いくつかのビリオンから構成され、そのうち10個のビリオンが選択され、処理ビリオンと未処理ビリオンの高さと幅を計算および比較しました。

実験は 3 回繰り返され、各実験で 3 つの反復が行われました。複数のグループを比較する場合、各実験の統計的有意性は分散分析 (ANOVA) とダネットの事後検定を使用して決定されました (*p < 0.05、**p < 0.01、***P < 0.001、****P <) 0.0001。計算は、Prism 6.0 ソフトウェア (GraphPad) を使用して実行され、グラフが作成されました。結果のグラフは平均値を示し、誤差バーは平均値に平均値をプラスまたはマイナスした標準誤差を示します。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、責任著者からのリクエストに応じて入手できます。

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この研究は、SSM (IK6BX006032) への上級研究キャリア科学者賞、SM (IK6BX004212) への研究キャリア科学者賞、SSM (BX003685) および SM (BX005490 および BX003413) への退役軍人省メリットレビュー賞によって部分的に支援されています。この報告書は退役軍人省、退役軍人保健局、研究開発局の一部支援を受けた研究に基づいていますが、この報告書の内容は退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。。さらに、この研究はDVVに対する南フロリダ大学開発助成金とSSMおよびSMに対するPRRN-Rapid COVID助成金によって部分的に支援されています。

これらの著者は同様に貢献しました: Sharad Ambardar、Mark C. Howell、Karthick Mayilsamy。

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シャラド・アンバルダル & ドミトリ・V・ヴォロニン

退役軍人局、ジェームス A. ヘイリー退役軍人病院、タンパ、フロリダ州、33612、米国

マーク・C・ハウエル・ジュニア、アンドリュー・マッギル、ライアン・グリーン、スブラ・モハパトラ、シャム・S・モハパトラ

南フロリダ大学モルサニ医科大学内科、12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2511、タンパ、フロリダ州、33612、米国

マーク・C・ハウエル・ジュニア、アンドリュー・マッギル、ライアン・グリーン、シャム・S・モハパトラ

南フロリダ大学モルサニ医科大学分子医学科、12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2525、タンパ、フロリダ州、33612、米国

カーシック・メイルサミー、アンドリュー・マッギル、スブラ・モハパトラ

南フロリダ大学物理学科、タンパ、フロリダ州、33612、米国

ドミトリ・V・ボロニネ

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文献検索およびデータ分析: SA、MCH、RG、ARM、KM レーザーおよび空洞研究: SA、MCH、RG、KM、RG、SM、SSM、および DVV ウイルス不活化分析: SA、MCH、RG、KM、SM、DVVおよび SSM 原稿を執筆しました: SA、MCH、RG、ARM、RD、SM、DVV および SSM 図の図: SA、MCH、KM、ARM、SM、DVV および SSM すべての著者が原稿の出版版を読み、同意しました。

スブラ・モハパトラ、ドミトリ・V・ヴォロニン、またはシャム・S・モハパトラへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ambardar、S.、Howell、MC、Mayilsamy、K. 他。 SARS-CoV-2 およびその他のウイルスを不活化するための超高速 UV レーザー統合キャビティデバイス。 Sci Rep 12、11935 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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受信日: 2022 年 1 月 28 日

受理日: 2022 年 5 月 26 日

公開日: 2022 年 7 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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