尿道ステント内の細菌バイオフィルムに対する405 nmレーザー光の抑制効果

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3908 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

尿道ステントの臨床使用は通常、排尿障害、発熱、尿路感染症（UTI）などのさまざまな副作用によって複雑になります。 ステントに付着したバイオフィルム（大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌などの細菌によって形成される）は、ステント留置患者（約 11%）に尿路感染症を引き起こします。 抗生物質の使用による望ましくない結果としては、細菌耐性、体重増加、抗生物質を長期間使用すると発生する 1 型糖尿病などが挙げられます。 私たちは、尿道ステント内の細菌の増殖を抑制するための 405 nm レーザーを用いた新しい光学治療の有効性を in vitro で評価することを目的としました。 尿道ステントを黄色ブドウ球菌ブロス培地中で 3 日間増殖させ、動的条件下でバイオフィルム形成を誘導しました。 405 nm レーザー光のさまざまな照射時間をテストしました (5 分、10 分、15 分)。 バイオフィルムに対する光処理の有効性を定量的および定性的に評価しました。 活性酸素種の生成は、405 nm 照射後の尿道ステント上のバイオフィルムの除去に役立ちました。 阻害率は、0.3 W/cm2 で 10 分間の照射後のコロニー形成単位/mL 細菌の 2.2 log 減少に相当しました。 SYTO 9 およびヨウ化プロピジウム染色によって実証されるように、処理されたステントは、未処理のステントと比較してバイオフィルム形成の大幅な減少を示しました。 CCD-986sk 細胞株を使用した MTT アッセイでは、10 分間の照射後に毒性は示されませんでした。 我々は、405 nm レーザー光による光学的治療は、毒性をまったく示さないか、最小限に抑えながら、尿道ステント内の細菌の増殖を阻害すると結論付けています。

尿道ステント (US) は、さまざまな病気によって引き起こされる膀胱出口閉塞の治療に使用されます。 尿道狭窄疾患、前立腺肥大症（BPH）、および排尿筋括約筋の統合不全（DSD）は、適格な患者における US 挿入の適応症です 1。 通常、US は、尿道の開存性を維持するのに十分な堅牢性を備えた金属合金 (ニチノール)、ポリマー材料、または生分解性材料で作られています。 カルハら。 は、再発性尿道狭窄患者に対する米国での長期有効性が 63% であると報告しています2。 したがって、ステントの移動、外皮形成、慢性尿路感染症、尿道痛、再狭窄などのステント挿入の失敗は、ステント留置の合併症となります3。 リードルら。 慢性的にステントを留置している患者はすべて、ステント定着と細菌尿を患っていることを発見しました。 一時的なステントも広く定着しており、発生率は 69% で、患者の 45% が細菌尿の影響を受けています。 このような微生物の定着はUTI4の原因となります。 尿路感染症は、大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌）などのグラム陽性菌およびグラム陰性菌、および特定の真菌によって引き起こされます5。

無菌 US を人体に埋め込むと、尿路感染症が発生する可能性があります。 バイオフィルムとは、表面に組織化されたコミュニティを形成する細菌とその細胞外副産物の蓄積を指します6。 バイオフィルムの成長は、人体に埋め込まれた異物や機器に大きな影響を与えます。 US、埋め込み型デバイス、スリングなどの幅広い異物が、過去数十年にわたって泌尿器科用途向けに開発されてきました6。 したがって、インプラントの表面では、バイオフィルムは高度に構造化されており、活発に増殖する細菌、タンパク質、細胞外ポリマーの集団で構成されています。 バイオフィルム形成の増加により、抗生物質に対する細菌の耐性や慢性感染症が生じる可能性があります7。

現在、尿路感染症を防ぐために抗生物質とステント表面コーティングが使用されています8。 ほとんどの抗生物質は一般的なものですが、一部の抗生物質は長期間使用すると潜在的な副作用を引き起こします9。 抗生物質の使用のリスクには、細菌耐性、肥満、糖尿病が含まれます10。 抗生物質の使用による悪影響には、セリアック病様疾患を引き起こす吸収不良、薬物吸収の低下、ビタミンの代謝と吸収の変化、耐性菌による定着、感染症に対する感受性の変化などが含まれる可能性があります11。 光ファイバーを介して細菌を抑制するためのレーザー応用は、これらの問題に対処する代替方法として注目を集めています 12,13。

幅広い波長（400 ～ 1000 nm）を適用でき、波長の中でも青色光は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、ヘリコバクター ピロリ菌など、さまざまな細菌種の生存率を低下させる効果があることが示されています。 、ポルフィロモナス・ジンジバリス、および緑膿菌は、高放射照度でのほとんどのスペクトルは、低放射照度でも光熱効果によって細菌を殺すことができます14,15。 紫外線 (UV) 光などの別のレーザー源も殺菌剤としてよく知られています。 しかし、哺乳類の組織に対する細胞毒性の影響により、生体内での UV 光の使用は制限されています 16。 ダイさんら。 中心線感染症に対する紫外線治療を研究しているときに、ケラチノサイトが 57% 失われることを発見しました 14。 この細胞毒性は、有効な抗菌剤であるにもかかわらず、UV 光の適用が生体組織にとって理想的な選択ではない可能性があることを示しています 17。 したがって、405 nm のレーザー光 (青色光) は細菌の消毒に広く使用されています 18,19。 マクリーンら。 彼らは、細菌への酸化的損傷と 405 nm の波長でのポルフィリンの光励起が最も高い殺菌活性を生成する可能性があることに同意しました 20,21。 さらに、ポルフィリンおよびその他の光活性物質は、405 nm の光の吸収の結果として活性酸素種 (ROS) を生成することにより、細菌を除染することができます。 ROS は、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシル ラジカルで構成されるフリー ラジカルの一種です。 細菌の細胞毒性中、紫青色光 (405 nm) にさらされると、内因性光増感分子 (ポルフィリン) が光励起され、ROS が生成されます。 ROS が十分に産生されると、酸化ストレスによる細胞溶解が起こります。 一般に、細菌における ROS の産生には、光線力学療法 (PDT) 中の 2 つの経路、タイプ 1 とタイプ 2 が関与します。タイプ 1 では、内因性ポルフィリンがタンパク質、脂質、核酸、その他の微小分子を含む細胞成分と直接反応します。 、スーパーオキシドアニオンとヒドロキシルラジカルを生成し、これが他のROS分子の生成につながります。 タイプ 2 では、ポルフィリンが分子酸素と結合して一重項酸素を形成します。 このメカニズムはその後、光にさらされた細菌細胞に酸化的損傷をもたらし、細胞死を引き起こします 21,22。 細菌膜の破壊や DNA 損傷などの他のメカニズムも青色光の影響であることが報告されています 23。

尿路感染症の治療には抗生物質が使用されてきましたが、現在の薬剤には肥満や細菌耐性などのさまざまな副作用が依然として伴います。 現在の研究の目的は、光学装置を介して米国で増殖した細菌バイオフィルムにレーザー光を照射することにより、尿路感染症の代替治療法を検討することでした。 尿路感染症を予防するためのステント留置患者の光線療法として、405 nm のレーザー光を使用すると細菌のバイオフィルムを抑制できるという仮説が立てられました。 この in vitro 研究は、尿路感染症の代替治療の第一段階研究として設計されました。 バスケット一体型光学装置からの 405 nm レーザーを使用して、米国の内面に光を照射しました。 安全性評価のために、MTT アッセイを使用して、ヒト細胞株における細菌バイオフィルムの形成を阻害する光線療法剤としての 405 nm レーザー光の効果を評価しました。 提案された光学的治療は、ステント留置患者の細菌感染に対する実行可能な代替治療となり得る。

米国における細菌の培養条件を CV 染色法を使用して分析し、培養時間中の細菌の生存率の概算を推定しました。 図 1a (培養 0 ～ 3 日) に基づいて、毎日異なるバイオフィルム形成が示されます。 図1bに示すように、CV染色はバイオフィルムの高速視覚化に使用される挿入色素として機能し、染色により細胞の定量化が可能になりました。 3 日目のバイオフィルム形成の推定値は、0 日目と比較して 80% 以上に達しました。

細菌バイオフィルムの成長：（a）培養後のさまざまな時点でクリスタルバイオレットで染色した尿道ステント、および（b）培養時間に対する細菌の生存率。

405 nm レーザー光を使用して US から細菌バイオフィルムを除去する代替方法を選択するために、治療前と治療後の両方の設定で細胞生存率を評価するために MTT 実験が実行されました。 処理細胞は、コントロールと比較して、24 時間のインキュベーション後に 2% (5 分)、4% (10 分)、および 10% (15 分) の細胞生存率の減少を示しました (p < 0.05)。 MTT アッセイの結果は、15 分間のレーザー照射が細胞に毒性効果を引き起こし、10% 以上の細胞減少につながることを実証しました (図 2a)。 図2bの温度推移は、15分間の照射で最高温度が32℃に達したことを示しています。

405 nm レーザー照射に対する正常細胞 (CCD-986sk) の応答: (a) さまざまな照射時間の細胞生存率 (CTRL = 対照; (*p < 0.05 vs. CTRL; N = 5)、および (b) レーザー中の温度変化DMEM 媒体中の CCD-986sk 懸濁液の表面への照射。

黄色ブドウ球菌に対する 405 nm レーザー光の阻害効果を評価するために、CV 染色を利用してレーザー治療前後の細菌の生存を計算しました。 図3aに示すように、細菌の生存率は5分で26％（p < 0.05）、10分で59％（p < 0.001）、15分で68％（p < 0.001）減少しました。 ステント表面の最高温度は 37.5 °C に達しました (図 3b)。

405 nm レーザー照射後の細菌バイオフィルムの阻害：（a）さまざまな照射時間で 405 nm レーザー光を照射した後の細菌の生存率（CTRL = コントロール; *p < 0.05 および **p < 0.001 対 CTRL; N = 5）および(b) 尿道ステント表面へのレーザー照射中の温度変化。

図 4a は、405 nm 照射後の CFU における黄色ブドウ球菌の測定を示しており、各処理条件は異なる数のコロニーを示しています (N = 10)。 結果は、総コロニーが照射後に減少し、log CFU/mL (5、10、および 15 分間で 1.2 log、2.2 log、および 3.2 log 減少) で表されることを示しました (図 4b)。 最大阻害は15分間の照射（270 J/cm2）で3.2 log減少（p < 0.01）に達しましたが、同じ条件下のヒト細胞生存率（CCD-986sk）（図2a）も10％以上減少しました。 。 したがって、10分間のレーザー照射は、安全な治療線量で米国でのバイオフィルム形成を防止するための最小阻害率（2〜3 log減少）を達成できました。

さまざまな照射時間で 405 nm レーザーを照射した後の黄色ブドウ球菌の細菌阻害: (a) 寒天プレート上の細菌細胞 (CTRL = コントロール)、および (b) log CFU/mL での細菌除去の定量化 (*p < 0.05 および ** CTRL に対して p < 0.01; N = 10)。

図 5a は、細胞膜に入り込んだ NBT 染色によって測定された ROS 生成のレベルを示しています。 結果は、NBT がすべての処理条件で ROS の生成を検出できることを示しています。 ROS 生成の結果は、5 分間、10 分間、15 分間でそれぞれ 21.7、46.7、および 74.4% (p < 0.05) でした。 この結果によると、405 nm レーザーをより長く照射すると、細胞死に影響を与える ROS がより多く生成される可能性があります。 図 5b は、DPPH アッセイを使用した抗酸化物質の除去活性の結果を示しています。 この結果は、405nmレーザー光の照射時間に基づいて、ROS生成後のフリーラジカルが増加することを示しています。 治療条件 (5、10、および 15 分) は、対照と比較して、それぞれ 22% (p < 0.05)、43% (p < 0.001)、および 62% (p < 0.001) の抗酸化活性に達しました。 対照群（レーザー治療なし）は最小の抗酸化能力を示しましたが、治療群は光線量の増加とともに抗酸化能力が増加しました。 15 分間というより長い用量を投与された細菌グループでは、対照と比較して DPPH 消去活性が統計的に有意に増加していることが明らかになりました (p < 0.05)。 図 5c は、Lowry 法を使用した処理前後のタンパク質漏出濃度を示しています。 5、10、および 15 分でのタンパク質漏出濃度の観察では、それぞれ 37、71、および 69 μg/mL に達しました。 レーザー治療後のタンパク質漏出量はレーザー照射10分で最大となり、15分で減少しました。 10分間のレーザー照射と比較して、15分間の照射ではタンパク質濃度が低下したため、タンパク質漏出活性は10分間の処理後に定常状態に達しました(p=0.92)。 これらの発見は、405 nm レーザーが細菌の酸化ストレスを増大させ、損傷した細菌膜からタンパク質を漏出させることにより、細菌の死滅を促進する可能性があることを示唆しました。

尿道ステント内の黄色ブドウ球菌に対する 405 nm レーザー光の光阻害効果: (a) 治療中の ROS 生成、(b) DPPH 消去活性、および (c) Lowry 法を使用したタンパク質漏出濃度 (*p < 0.05 および ** CTRL に対して p < 0.001; ns = 有意ではない; N = 5)、および (d) レーザー治療後の黄色ブドウ球菌の SEM 画像 (青、オレンジ、赤の矢印は、厚いバイオフィルム、バイオフィルムから放出された細菌、および細菌の死を表します)形態的損傷あり (スケール バー = 2 μm; 20 kX、入口のスケール バー = 20 μm; 2 kX)。

4つの異なる処理条件にさらされた細菌バイオフィルムの膜完全性の損失をSEM（図5d）に、蛍光画像を図6（CTRL、5、10、および15分）に示します。 未処理の対照では、かなりの割合の細菌コロニーが細胞外ポリマー材料（青い矢印）で作られた厚いバイオフィルム構造に発達しました（図5d（CTRL））。 図5d（5分）によると、405 nmのレーザー光はバイオフィルムを破壊し、バイオフィルムを単一細胞に放出しました（オレンジ色の矢印）。 米国に堆積されたバイオフィルム内の細菌コロニーは、無傷のバイオフィルム形態が存在しないことを示した。 図 5d (10 分および 15 分) では、一部の細菌が損傷しており (赤い矢印)、細胞死を示しており、細菌は米国から除去されました。

レーザー処理後の細菌膜の完全性の分析: (a) SYTO 9 で染色した生菌、(b) PI で染色した死菌、(c) 生菌のピクセル強度の定量化 (緑色の強度)、および (d) ピクセルの定量化死んだ細菌の強度 (赤色の強度) (**p < 0.001 vs. CTRL; ns = 有意ではない; N = 7; スケール バー = 100 μm; 40X)。

蛍光画像評価では、405 nm レーザー光を照射すると細菌細胞の数が大幅に減少し、無傷の細胞膜がほとんど残っていないことが示されました。 SYTO 9 は、残った無傷の膜を生きた細菌 (緑色) としてマークし、処理後の個体数はコントロールの個体数よりも少なくなりました (図 6a)。 ヨウ化プロピジウム（PI）は、処理後の細菌の数が対照よりも多いことを示しました。これは、処理後に赤色で表されるより多くの膜損傷を意味します（図6b）。 緑色の強度で表される生きた細菌の定量化（図6c）により、405 nmレーザー光が米国の細菌バイオフィルムを阻害できることが確認され、これはSEM画像の結果（5、10で62、21、および4％）とよく一致しています。 、および 15 分 (それぞれ p < 0.001))。 死んだ細菌の定量化により、405 nmレーザー光が、405 nmレーザー照射後により高い赤色強度を獲得した細菌（それぞれ、5、10、および15分間で17、68、および98％）を阻害できることが検証されました（図6d） ）。

現在の研究では、細菌バイオフィルムが発達した US に対する 405 nm レーザー光の効果を理解することを試みました。 レーザー治療は、副作用を防ぐために抗生物質の使用を代替または補助する試みとして使用されました。 尿路感染症を予防する別の治療法はステント除去であるが、それに伴い、外傷や、ステント除去後の主要な泌尿器科合併症や尿道閉塞などのその他のリスクが依然として発生する24,25。 したがって、レーザー照射などの代替治療は、尿路感染症を予防するための別の選択肢となりえます。

米国では、405 nm レーザー光には細菌のバイオフィルム形成を阻害する能力があります。 バイオフィルム形成を阻害するメカニズムは ROS の生成に依存しており、ROS の生成は膜の崩壊や細胞死に影響を与える可能性があります 26,27。 以前の研究 28 によれば、細菌細胞の内因性ポルフィリンは 405 nm のレーザー光を選択的に吸収し、細菌を効果的に殺すのに必要な細胞内 ROS を生成しました。 さらに、ROS の存在は脂質の過酸化、タンパク質と核酸の酸化、酵素阻害を引き起こす可能性があり、これらすべてが微生物を破壊する可能性があります 21。 ジュリアーノら。 は、泌尿器科手術を受けて尿培養陽性となった典型的な患者には 103 個のコロニーがあると報告しました 29。 今回の研究による細菌の減少により、405 nm レーザー光を使用した抑制により、放射照度 0.3 W/cm2 で 15 分間レーザーに曝露した後、3 log 減少を超えて減少できることが確認されました。 この状態は正常細胞に対してわずかな毒性しかありませんでしたが (図 2)、臨床応用の前にこの治療の安全用量を確認する必要があります。 バウアーら。 らは、405 nm レーザー照射後の 300 J/cm2 で細胞毒性効果が見られたと報告しました 30。 15 分間のレーザー照射 (270 J/cm2) 後に実行された MTT アッセイでも、10% を超える細胞減少を伴う細胞毒性効果が確認されました。 したがって、405 nm レーザー光の 10 分間のレーザー照射は、細胞減少が 10% 未満、細菌対数減少が 2.2 未満の安全線量 (180 J/cm2) である可能性があります。

405 nm レーザー処理後の ROS 生成は、スーパーオキシド イオンと相互作用して不溶性で安定した細胞内紫/青色ホルマザン沈殿物を生成する NBT 染色を使用して検査されました 31。 ROS の生成は、細菌に対する 405 nm レーザーの照射時間の影響を受けます。 バクテリアに長時間露光すると、各条件でより多くの ROS が検出されます。 さらに、ROS の影響を受ける消去活性を DPPH アッセイによって実行したところ、レーザー治療後の ROS 生成と同様の結果が得られました。 細菌と相互作用してDPPHに水素を供与し、それをDPPH-Hに変換する405 nmレーザーの能力は、フリーラジカル消去効果であると考えられています。 この現象は、ラジカル紫色 (DPPH) が黄色色 (DPPH-H) に変化した後の吸光度値の減少をもたらしました 32。 さらに、ローリー法によるタンパク質漏出量の推定を用いて、細菌細胞に対する405nmレーザー光の効果を確認した。 興味深いことに、治療後のタンパク質漏出濃度は増加しましたが、15分間の照射では、開始時のタンパク質濃度が減少し、おそらく長時間のレーザー照射によるタンパク質分子の崩壊のため、タンパク質放出量が減少しました。 タンパク質濃度の最大量は 10 分間に発生し、71 µg/mL でした。 タンパク質は必須の細胞内成分の一種であるため 33、タンパク質の漏出は、細胞質漏出、脂質層 34 および細胞膜の損傷 35 の両方を含む兆候であると考えられます。

形態細胞に対する 405 nm レーザーの効果は 405 nm レーザー照射時間に依存し、10 分および 15 分でバイオフィルムの除去と細胞の損傷が生じました。 細菌のSEM画像で確認できる膜の崩壊により、真円から収縮した円に構造が変化します。 細菌細胞が生きているか死んでいるかを判断する 1 つの基準は、細胞と膜の完全性であると考えられています。 生細胞は、一部の染色に対して不透過性の無傷で緊密な細胞膜を有すると考えられていますが、死細胞は破壊および/または損傷した膜を持っていると考えられています 36。 SYTO 9 染色は DNA および RNA に結合して緑色の蛍光を発しますが、PI は膜が損傷した細胞のみに侵入でき、DNA および RNA に結合して赤色の蛍光シグナルを発します 37。 10 分および 15 分のレーザー照射後の膜の完全性の損失は、対照と比較して緑色のピクセル強度が低く、赤色のピクセル強度が高かった。 405nmレーザーにより細菌の膜破壊が起こり、処理後の死菌から赤色蛍光シグナルが発せられることが確認されました。

臨床応用では、提案された方法は、バスケット一体型光学デバイスを尿道に挿入し、米国に配置することにより、尿路感染症患者に使用されることが期待されています。 尿道チャネルに配置された拡散光ファイバーは、留置された US の表面に 405 nm レーザー光を照射して、光阻害効果により US 上の細菌バイオフィルムの形成を防止または最小限に抑えることができます。 したがって、今後の研究では、臨床用量を探索し、尿道チャネルと末梢組織に最適な用量を適応させるために、生体内モデルをテストする必要があります。 103 個のコロニーを除去するための最小阻害率は、リアルタイム条件下では異なる可能性があります。したがって、尿道チャネルを模倣できる条件下で実験を実行する必要があります。 ステント留置患者における尿路感染症の治療法の一つとするとともに、尿道閉塞や尿道狭窄などの泌尿器科疾患に対する光阻害効果を解明し、モニタリングする必要がある。 最後に、パイロット研究を実行して、レーザー出力、照射時間、治療回数と期間などの臨床治療条件を特定して最適化し、臨床翻訳の有効性と安全性を検証する必要があります。

結論として、今回の研究は、米国における細菌抑制に対する 405 nm レーザー光の有効性を示し、2 ～ 3 log の細菌減少と安全マージンを示しました。 バイオフィルムへの 405 nm レーザー照射後の ROS 生成は、タンパク質の漏出、膜の崩壊に寄与し、細胞死に影響を与えました。 さらなる研究では、抗生物質の長期使用によって引き起こされる細菌耐性の存在を軽減することにより、ステント留置患者の尿路感染症のリスクを軽減するために、生体内での多細菌を使用した同時細菌抑制を調べる予定です。

無菌 US は UVENTA™ 尿道ステントから購入しました。 テウンメディカル、韓国。 US は自己拡張可能で、長さ 80 mm、直径 10 mm で、ニチノール ワイヤで作られ、シリコン (生分解性ではありません) の薄い層で覆われた移植可能な完全被覆金属構造で構成されていました。 細菌ストック培養物（−８０℃）からの黄色ブドウ球菌（ＫＣＴＣ １９１６）を寒天プレートに置き、２４時間接種した。 次に、細菌をトリプシン大豆ブロス (TSB) (50 mL) で継代培養し、37 °C のインキュベーターで 24 時間インキュベートしました。 細菌コロニーの数を決定するために、マクファーランド法 38 を使用して、10 mL 中に 108 個のコロニーが得られました。 最初に、細菌懸濁液注入 (10 mL) を使用して、新鮮な培地を小さなシリコン チューブ (内径 = 4 mm、外径 = 5 mm、韓国、ソンジン) にポンプで注入しました (P1 = 1.5 mL/分)。 次に、P1 がシリコン チューブ全体にメディアを排出するときに 2 番目のポンプ (P2 = 50 mL/min) がオンになり、より大きなシリコン メディア (内径 = 10 mm、外径 = 12 mm、Sungjin) を排出するために使用されました。韓国）3日間。 US を大きなシリコンチューブに入れ、シリコンを 37 °C の水浴中に置きました。 その後、使用した培地を別のボトルに流し込みました。 米国では細菌が増殖して均一なバイオフィルムを形成するのを防ぐために、P1 を使用して新鮮な培地を 4 時間ごとにポンプで送りました。 現在のプロセスは、米国における in vitro での細菌バイオフィルムの開発に焦点を当てており、臨床状態をほとんど模倣していないことに注意する必要があります。 図 7A はセットアップを示しています。 3日間培養した後、図7bに示すように、USをクリスタルバイオレット（CV）で染色して、培養日数中にバイオフィルムが形成されたかどうかを判断しました。

細菌調製の概略図：（a）動的条件下での尿道ステント内での細菌培養、（b）培養前（0日目）および培養後の尿道ステントの例、および（c）405 nmレーザー治療のセットアップ。 (3 日目; クリスタルバイオレットで染色; TSB = トリプシン大豆ブロス培地; SA = 黄色ブドウ球菌懸濁液; WB = ウォーターバス; US = 尿道ステント; UM = 使用した培地;P1、P2 = ポンプ、S1 = 小型シリコン、S2 = 大きなシリコン、DF = 拡散繊維)。

この研究で使用されたバスケット一体型光学デバイスは、以前の研究からバスケットデバイスに使用されたバスケットの形状、直径（10 mm）、および材料の特性を変更することによって適合されました39。 光学ディフューザーと一体化したこのバスケットは、米国に設置したときに拡散ファイバーの位置を中央に維持し、光の広がりが全方向に均一になるようにすることを目的としています。 青色光 (405 nm; 中国、長春の CNI レーザー) を放射照度 0.3 W/cm2 の光源として使用しました。 照射時間は5分、10分、15分と処理条件を変えました。 対照は未処理の状態であった。 対応するフルエンスは 90、180、および 270 J/cm2 でした。 治療部位はステントを長さ10mmに切断し、ステント内に405nmのレーザー光を照射しました。 培養した US を直立ホルダーに置き、バスケット一体型デバイスを同じ方向に配置して US の中央に挿入する実験装置を開発しました。 赤外線カメラ (FLIR A325、320 × 240 ピクセル、解像度 = 25 μm、スペクトル範囲 = 7.5 ～ 13 μm、FLIR、オレゴン州ウィルソンビル) を米国地表から 30 cm 上に設置し、パーソナル コンピューターで制御して、作業中の温度上昇を監視しました。治療（図7c）。

3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) アッセイを使用して、405 nm レーザー光の安全性と毒性を評価しました。 。 CCD-986sk 細胞株 (韓国細胞株バンクから入手) をすべての処理条件で正常細胞株として使用しました。 CCD-986sk 細胞を 37 °C のウォーターバスで解凍し、15 mL のコニカルチューブに入れ、3 mL のダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Corning、NY、USA) を加え、懸濁液を 1000 × で遠心分離しました。 gで5分間。 上清を除去し、細胞を10 mLのDMEMを含む培養皿に48時間置きました。 細胞の継代培養を 2 日または 3 日ごとに実行して、MTT アッセイ用の安定した細胞株を取得しました。 安定した細胞株を計数し、24 ウェル プレートに播種し、処理前に細胞を十分に増殖させるために 24 時間インキュベートしました。 細胞は、0.3 W/cm2 の放射照度で US に適用される処理条件 (照射時間: 5、10、および 15 分) に従って処理されました。 処理した細胞を 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、培地を除去し、MTT 溶液を添加し、暗所、37 °C で 3 時間インキュベートしました。 MTT 溶液を除去し、ジメチルスルホキシド (DMSO) に置き換え、15 分間インキュベートしました。 吸光度は、マイクロプレートリーダー（Multiskan GO、Thermo Fisher Scientific、Waltham、マサチューセッツ州、米国；条件ごとに N = 10）を使用して 570 nm で分光測光的に測定しました。

処理後、CV 染色を使用して、US を蒸留水で洗浄し、CV 溶液中で 20 分間インキュベートすることにより細菌の生存率を推定しました。 続いて、可溶化溶液（５％蒸留水を含む９５％エタノール）を添加し、１０分間超音波処理した。 細菌溶液を 96 ウェル プレートに置き、マイクロプレート リーダー (Multiskan GO、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム、条件あたり N = 10) を使用して 570 nm での吸光度を測定しました。 さらに、細菌の生存率をコロニー形成単位 (CFU) の観点から計算しました。 10 ミリメートルの US を 1 mL の蒸留水で洗浄し、15 mL のコニカルチューブに入れた。 USを10分間超音波処理し、5分間ボルテックスした。 次に、細菌懸濁液を 10 倍に希釈し、100 μL の懸濁液をトリプシン大豆寒天 (TSA) プレート上に広げ、37 °C で 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、OpenCFU40 を使用して寒天プレートを分析し、細菌コロニーの数を計算しました。これは、10 mm US 表面上の細菌の生存率の対数で表されます (CFU/mL、条件ごとに N = 10)。

提案された処理の主なメカニズムを調査するために、対照および処理済み US の両方を 1 mL の蒸留水が入った 15 mL コニカル チューブに入れ、20 分間超音波処理し、5 分間ボルテックスして US 内の細菌を分離しました。 ニトロブルーテトラゾリウム (NBT) の 1 mg 溶液をチューブに加え、暗所で 30 分間インキュベートしました。 細菌とNBTの相互作用を阻害するために0.1 M HClを溶液に添加した後、すべてのチューブを12,000 × gで5分間遠心分離しました。 細胞間 ROS を放出するために、ペレットを最初に 800 mL の生理食塩水と 400 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) で処理しました。 ROS 生成を推定するために、200 μL の各サンプルを 96 ウェル プレートに置き、575 nm で測定しました (条件ごとに N = 5)。 収集された ROS 生成は、超音波処理手順によって引き起こされる実験誤差を排除するために、対照サンプルの吸光度によって正規化されました。 次の方程式を使用して、細胞間 ROS 増幅 (Ri) のレベルを決定しました。

ここで、Ac はコントロールの吸光度、At は処理サンプルの吸光度です。

1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル (DPPH) は、ROS 生成後のさまざまな抗酸化剤の一般的なラジカル消去能力を評価するために使用される安定なフリーラジカルです。 DPPH アッセイは、DPPH 溶液 (40 μg/mL メタノール) を対照細胞と処理細胞に添加し、暗所で 30 分間インキュベートすることによって実行されました。 ＵＶ分光光度計を使用して５１７ｎｍの吸光度を検出し、実験を５回繰り返した。 対数投与量阻害曲線を使用して、標準物質の IC50 値 41 を取得しました。これは、DPPH フリーラジカルの 50% を阻害するのに必要な標準物質の濃度です。 反応混合物の吸光度が低いことは、フリーラジカル活性が増加していることを示唆しています。 次の方程式を使用して、DPPH スカベンジング (Ds) 効果のパーセンテージを計算しました。

ここで、Ac はコントロールの吸光度、At は処理サンプルの吸光度です。

Lowry et al. によって記載された方法。 (1951) は、405 nm レーザー光による 24 時間の処理の前後に黄色ブドウ球菌細胞から放出されたタンパク質 (106 CFU/mL) を評価するために使用されました。 吸光度は660 nmで分光測光的に測定した。 放出されたタンパク質の量は、前述したように、ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して検量線から式を外挿することによって決定されました 42。

バイオフィルム形成構造を評価するために、対照および処理済み US を蒸留水で数回洗浄し、pH 7.5 の 2.5% グルタルアルデヒドを使用して室温 (26 °C) で 4 時間固定しました。 インキュベーション後、US を 100% エタノールで洗浄し、室温で放置して乾燥させました。 対照および処理済み US を小片 (5 mm) に切断し、SEM 分析のために金パラジウムで覆いました。

LIVE/DEAD BacLight 細菌生存率キット (Bio Probes、ユージーン、オレゴン州、米国) を使用して、対照ステントと処理済みステントの膜の完全性に基づいて生菌と死菌を評価しました。 対照および処理済みＵＳからの細菌懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ステントに付着した細菌バイオフィルムを収集した。 次に、SYTO 9 およびヨウ化プロピジウム (PI) 染色を 1:1 の濃度で添加し、15 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、1 μL の懸濁液をスライドガラスに加え、蛍光顕微鏡下でカバースリップで覆いました。 生菌と死菌はそれ​​ぞれ緑と赤で表されます。 蛍光画像の定量分析は、緑と赤のピクセル強度の合計数を使用し、Image J (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) で RGB 値を計算することによって実行されました。

データは、4 つの条件下での平均と標準偏差として表されます。1 つは対照として、もう 3 つの他の治療条件 (照射時間: 5、10、および 15 分)。 各条件 (対照および治療) を 5 回繰り返しました (N = 5)。 適切なデータを確保するために、CFU 分析を 10 回繰り返して実行しました。 マン・ホイットニー U 検定を使用して、対照条件とタイプ条件を比較することによってすべての条件を評価しました。 SPSS (SPSS、シカゴ、米国) を統計分析に使用し、p < 0.05 を統計的に有意であるとみなしました。

この記事には、著者らによって行われた人間の参加者を対象とした研究は含まれていません。

この研究の結果を裏付けるために使用されたすべての関連データが記事内に含まれています。 追加の情報とデータは、合理的な要求に応じて著者 (LM; [email protected]) から入手できます。

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著者らは、この研究における分析の技術的ガイドを提供してくださった、韓国釜山国立大学国立主要研究機関海洋統合生物医学技術センターの博士研究員である Sirajunnisa Abdul Razack 博士に感謝したいと思います。

この研究は、韓国政府（MSIT）が資金提供する韓国国立研究財団（NRF）助成金（番号2021R1A2C2003733）と、教育省が資金提供する韓国国立研究財団（NRF）を通じた基礎科学研究プログラムによって支援されました。 （第2021R1A6A1A03039211）。

インダストリー 4.0 コンバージェンス バイオニクス エンジニアリング、釜山、韓国の釜慶大学校

ルルイル・マクヌナ、ヴァン・ナム・トラン、カン・ヒョヌク

国立大学主要研究機関、海洋統合統合生物医学技術センター、釜山国立大学、韓国

ルルイル・マクヌナ & カン・ヒョヌク

韓国釜山、釜慶国立大学情報技術融合学部スマートヘルスケア部門

イ・ビョンイル＆カン・ヒョヌク

釜山国立大学生物医工学部、釜山、48513、韓国

カン・ヒョヌク

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LM、VNT、および HWK が研究を考案し、設計しました。 LMとVNTが実験を実施した。 LMはデータを分析して原稿を書きました。 BL はデータ分析を行い、原稿を修正し、資金提供を支援しました。 HWK は研究を監督し、原稿を修正し、最終版を承認しました。 著者全員が原稿を読んで承認しました。

カン・ヒョヌクさんへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

マクヌナ、L.、トラン、ベトナム、リー、BI。 他。 尿道ステント内の細菌バイオフィルムに対する 405 nm レーザー光の抑制効果。 Sci Rep 13、3908 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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受信日: 2022 年 9 月 28 日

受理日: 2023 年 2 月 20 日

公開日: 2023 年 3 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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